Jak2v617f基因过表达及SAA患者血清对小鼠32D细胞体外培养中细胞因子浓度的影响

张宇明　李宁　吴国才　聂丽容　何红华　彭晓东.广东医学院附属医院血液内科，广东湛江　54000；.广东医学院附属医院急诊科，广东湛江　54000



Jak2v617f基因过表达及SAA患者血清对小鼠32D细胞体外培养中细胞因子浓度的影响

张宇明1李宁1吴国才1聂丽容1何红华1彭晓东2
1.广东医学院附属医院血液内科，广东湛江524000；2.广东医学院附属医院急诊科，广东湛江524000

[摘要]目的观察Jak2v617f转染小鼠32D细胞后，与重症再生障碍性贫血患者（severe aplastic anemia，SAA）血清共培养，了解Jak2v617f对SAA患者血清细胞因子水平的影响。方法利用DNA克隆技术，将mutJAK2（v617f）慢病毒转染至32D细胞，检测未转染组与转染组细胞分别与正常血清与SAA患者血清培养后，血清细胞因子（IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α）水平的变化；同时观察未转染组细胞与SAA患者血清培养，加入Jak2抑制剂AZD148后，上述血清细胞因子水平的变化。结果SAA组（SAA血清+32D）与对照组（正常血清+32D）比较，血清细胞因子CD69差异无统计学意义（P>0.05），SAA组IL-2、IFN-γ则下降（P<0.05），TNF-α下降更明显（P<0.01）；Jak2v617f组（Jak2v617f+正常血清+32D）则相反，除TNF-α外，余血清细胞因子水平均显著高于对照组（P均< 0.01）；Jak2v617f+SAA组（Jak2v617f+SAA血清+32D）除CD69较对照组显著升高外（P<0.01），余与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；AZD148组（正常血清+32D+Jak2抑制剂）与对照组比较，除CD69（P>0.05）外，余细胞因子均较对照组减少（P<0.05或P<0.01）；SAA+AZD148组（SAA血清+32D+Jak2抑制剂）与对照组比较，除CD69较对照组显著升高（P<0.01）外，余均显著减少（P均<0.01）。结论小鼠32D细胞Jak2v617f基因的过表达，有利于弥补SAA血清细胞因子的消耗；小鼠32D细胞加入Jak2抑制剂则有可能加重SAA血清细胞因子的消耗。

[关键词]Jak2v617f；转染；SAA；细胞因子；AZD148

Jak2v617f基因突变多见于BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN），该病的临床表现主要有白细胞增多、血红蛋白增多及血小板增多等多血症的表现，也可出现血栓及出血[1，2]；再生障碍性贫血的临床表现则刚好相反，它主要表现为白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等骨髓衰竭的表现。Jak2v617f是骨髓增殖性肿瘤的致病因素[3，4]，而细胞因子则是再生障碍性贫血的致病因素[5]。本文探讨将此两种致病因素加以整合，能否将两者的致病作用相抵消，现报道如下。

1　资料与方法

1.1临床资料

选择2012年6月～2015年3月我院初治的SAA患者血清6例，均符合《血液病诊断及疗效标准》（第3版）中的诊断标准。其中，男3例、女3例，年龄22～45岁。同期选择我院健康体检者血清6例，其中男3例、女3例，年龄25～45岁。

1.2实验材料

mutJAK2（v617f）慢病毒由广州莱德尔生物科技有限公司协助制备；小鼠32D细胞由广州莱德尔生物科技有限公司提供；实验试剂：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640培养基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B）；Mouse IL-2 Platinum ELISA（e bioscience，Cat.No.BMS601）；MouseCD69Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS614/2）；Mouse IFN-γ Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS606）；Mouse TNF-α Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS607/3）。

1.3实验仪器

苏州安泰洁净工作台（SW-CJ-IFD），低速离心机（中佳，SC3614），倒置光学显微镜（OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2），细胞恒温培养箱（Thermo scientific，HERA CELL150i），倒置荧光显微镜（Leica，DMI6000B），流式细胞仪（BD，calibur）。

1.4实验方法

感染实验：将2×104L个32D细胞接种于96孔板，体积为100 μL，以第2天密度约50%左右为宜，37℃培养过夜；次日，从冰箱取出mutJak2（v617f）慢病毒，并在37℃水浴中快速融化（轻轻晃动约几秒，以溶化液体中有少量冰块为宜，立即取出），并立即用事先加热到37℃的新鲜完全培养基（使用前加入Polybrene，终浓度6 mg/mL）加入2×106TU病毒（病毒浓度由预实验确定），轻轻混匀；吸去32D细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中；轻摇匀，37℃培养过夜；感染后第2天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液（不含Polybrene），继续37℃培养；感染后第3天，观察GFP表达。另外，分别将2×105L个32D细胞接种于24孔板，按上述步骤加入慢病毒，准备以下实验。

1.5实验分组

实验分6组：对照组即小鼠32D细胞在含正常血清的培养基培养；SAA组即小鼠32D细胞在含SAA患者血清的培养基培养；Jak2v617f组即过表达Jak2v617f的小鼠32D细胞在含正常血清的培养基培养；Jak2v617f+SAA组即过表达Jak2v617f的小鼠32D细胞在含SAA患者血清的培养基培养；AZD148组即小鼠32D细胞在含正常血清及Jak2抑制剂培养基培养；SAA+AZD148组即小鼠32D细胞在含SAA患者血清及Jak2抑制剂培养基培养。

1.6推算直线方程

制定IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α等标准品的浓度曲线并推算直线方程。

1.6.1标准品稀释应用双蒸水稀释液重溶IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α标准品，重溶后标准品的浓度为500 pg/mL，重溶后静置10～30 min，稀释前充分混匀。

1.6.2分别制定IL-2的标准曲线，推算直线方程吸取225 μL样本稀释液到7个管，吸移225 μL重溶标准品（500 pg/mL）到第1管，标记为S1（250 pg/mL），吸取225 μL此稀释到第2管中，标记为S2（125 pg/mL），重复连续稀释液产生标准曲线的点（图1）。样本稀释液作为空白。

图1　样本连续稀释图

1.6.3推算直线方程同法制定CD69、IFN-γ及TNF-α标准曲线及推算直线方程。

1.7血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α检测

应用ELISA法检测各组样本血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α的浓度。

1.7.1具体步骤加入100 μL标准品到标准品孔、100 μL样本稀释液到空白孔、50 μL样本稀释液到样品孔、50 μL样本到样本孔，每组重复3管；所有孔加入50 μL生物素标记检测抗体，使用封板膜封板，400转/min振荡，室温孵育2 h，弃掉液体，400 μL洗液洗板3次，加入400 μL洗液静置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素到所有孔，使用封板膜封板；400转/min振荡，室温孵育1 h，弃掉液体，400 μL洗液洗板3次；加入400 μL洗液静置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔TMB显色液，室温避光反应10 min，每孔加入100 μL终止液终止反应。

1.7.2酶标仪测定设定酶标仪450 nm，波长测定OD值，参考波长设定为620 nm。

1.8统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件数据分析，所有数据均用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1鼠IL-2 ELISA检测

根据IL-2的OD值与浓度的关系，绘制直线见图2，并得到直线方程：y=0.0117x+0.1914，其中y代表OD值，x代表浓度（con），将各实验组OD值换算成浓度见表1，结果显示：SAA组、AZD148组（Jak2抑制剂）及SAA+AZD148组与对照组比较，血清IL-2水平均减少，差异具有统计学意义（前者P<0.05），后两组降低趋势差异有高度统计学意义（P<0.01）；Jak2v617f组及SAA+Jak2v617f组则相反，IL-2水平较对照组高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1、图2、3。

表1　鼠IL-2 ELISA检测及数据分析

图2　鼠IL-2 ELISA标准曲线

图3　各组样品检测IL-2含量比较

2.2鼠CD69 ELISA检测

利用2.1的检测方法，同理得出以下实验结果见表2、图4、5：与对照组比较，血清CD69水平除Jak2v617f组升高外（P<0.01），SAA组、SAA+Jak2v617f组、AZD148组（Jak2抑制剂）、SAA+AZD148组与对照组比较，CD69水平均下降（前两组P<0.05，后两组P< 0.01），见图4、5。

图4　鼠CD69 ELISA标准曲线

图5　样品检测鼠CD69含量比较

表2　鼠CD69 ELISA检测及数据分析

2.3鼠IFN-γ ELISA检测

利用2.1的检测方法，同理得出以下实验结果见表3、图6、7：与对照组比较，血清IFN-γ水平除Jak2v617f组升高外（但P>0.05），SAA组、SAA+AZD148组、SAA+Jak2v617f组及AZD148组（Jak2抑制剂），与对照组比较，IFN-γ水平均下降（前两组P<0.01，后两组P<0.05）。

表3　鼠IFN-γ ELISA检测及数据分析

图6　鼠IFN-γ ELISA标准曲线

图7　样品检测鼠IFN-γ含量

2.4鼠TNF-α ELISA检测

利用2.1的检测方法，同理得出以下实验结果见表4、图8、9：与对照组比较，血清TNF-α水平除SAA+ AZD148组（P<0.05）及AZD148组（P<0.01）与对照组比较升高外，SAA组、Jak2v617f组及SAA+Jak2v617f 组TNF-α水平均下降（P均<0.05）。

3　讨论

重症再生障碍性贫血是血液系统的危重疾病，骨髓呈严重的衰竭状态，其药物起效慢甚或无效，虽然治疗方面造血干细胞移植技术取得了很大进步[6，7]，但由于患者经济能力、年龄、病情严重程度等种种原因，仍有相当一部分患者难以挽回生命；而血液系统的另一种疾病骨髓增殖性肿瘤，疾病状况与再障则刚好相反，骨髓各系细胞显著增生，本课题研究旨在探讨上述两病的致病因素共存时，其致病作用能否得以缓和。

表4　鼠TNF-α ELISA检测及数据分析

图8　Mouse TNF-α ELISA标准曲线

图9　样品检测鼠TNF-α含量

本课题组之前的研究证实，重症再障患者的血清可抑制小鼠32D细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，相反，转染了Jak2v617f的小鼠32D细胞的增殖力则增强，细胞凋亡则减少，这些结论均与文献报道相仿[8-10]；另外将转染了Jak2v617f的小鼠32D细胞置于含重再患者血清的培养基中培养，即将两种致病因素加以整合，两者的致病作用相互抵消，细胞的增殖力及凋亡数趋向正常，这些数据将在另文报道[11]。

本实验研究结果显示：小鼠32D细胞用重症再障患者血清进行体外培养，检测血清白介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及CD69含量均较正常对照组减少，与文献报道不一致，重复实验结果也类似。既往研究显示[12]，T细胞的免疫激活是再生障碍性贫血的发生、发展的关键环节，T细胞激活后，由于其功能处于亢进状态，能分泌大量的细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，这些负调节因子作为一种致病因素将导致造血干细胞的损伤及增殖能力减退，并诱导造血干细胞的凋亡，进而引起骨髓衰竭即再障的发生；许多研究者也通过相关实验[13，14]证实再障患者体内IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量是升高的；本实验研究中IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量的减少可能由于重再患者血浆中的这些细胞因子作为致病因素，也能在体外作用于小鼠32D细胞，导致其类似再障的改变：比如增殖力减弱、凋亡增多等，并在此过程中上述细胞因子被消耗，而体外缺乏活化的T细胞，这些细胞因子难以持续分泌，故而减少。

本实验研究还显示：小鼠32D细胞转染了Jak 2v617f基因后用正常血清培养，血清中IL-2、IFN-γ水平及CD69含量较对照组高，TNF-α则减少，小鼠32D细胞在正常血清培养时，如加入Jak2抑制剂AZD148，则这四种细胞因子浓度刚好相反，除TNF-α升高外，其他三种均降低。Jak2v617f作为骨髓增殖性肿瘤的致病基因，其致病机制主要由于位于JH2区617位的缬氨酸被分子量更大苯丙氨酸取代，导致原折叠区域被打开，JH1活化环相互接近，Jak2持续活化，细胞对生长因子的敏感性增高，甚至在细胞因子不存在时，也能通过Jak2的活化及生长因子受体的作用，使细胞更多向红细胞、白细胞、血小板转化[15，16]；相反，加入Jak2抑制剂则有利于减少红细胞、白细胞及血小板的数目[17,18]。本文推测，与此同时，也存在对负调节因子敏感性降低的情况，IL-2、IFN-γ水平及CD69等因子被利用减少，另外Jak2活化，也可导致STATS及其下游激酶的改变，使细胞凋亡减少，遂导致IL-2、IFN-γ水平及CD69水平升高；也有可能某一途径激活后，这些因子分泌增多；TNF-α水平可能更为依赖于T细胞的活化，本实验活化T细胞较少，故TNF-α水平减低。如转染Jak2v617f基因的小鼠32D细胞加入重症再障患者血清培养，则在体外培养过程中，血清中上述细胞因子浓度趋向正常,说明这两种治病因素共存时，其致病作用得到抵消；如小鼠32D细胞在Jak2抑制剂AZD148及重症再障患者血清共存的环境下培养，上述细胞因子进一步下降，说明Jak2抑制剂AZD148有可能加重重症再障血清的致病作用。目前国内外类似研究甚少，其机制尚不清楚，有待进一步的研究证实。

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Influence of Jak2v617f overexpression and SAA patients'serum on cytokines concentrations in mice 32D cells in vitro culture

ZHANG Yuming1LI Ning1WU Guocai1NIE Lirong1HE Honghua1PENG Xiaodong2
1.Internal Hematology Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China;
2.Emergency Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China

[Abstract]Objective To observe Jak2v617f-transfected mice 32D cells which were co-cultured with severe aplastic anemia(SAA)patients'serum and to understand the impact of Jak2v617f on cytokines levels in SAA patients'serum. Methods DNA cloning technology was used to transfect the mutJak2(v617f)lentivirus into 32D cells,and changes of serum cytokines(IL-2,CD69,IFN-γ,changes in TNF-α)levels were detected after the untransfected group cells and the transfected cells were co-cultured with normal serum and SAA patients'serum respectively.And in the same time, changes of the serum cytokines levels were detected after the untransfected group cells were co-cultured with SAA patients'serum and Jak2 inhibitor ADZ148 was added to them.Results There was no significant difference in comparing serum cytokine CD69 of the SAA group(SAA serum+32D)and the control group(normal serum+32D)(P>0.05).Compared with the control group,IL-2,IFN-γ in SAA group decreased(P<0.05),and TNF-α in SAA group decreased more significantly(P<0.01).On the contrary,the remaining serum cytokines levels of the Jak2v617f group(Jak2v617f+normal serum+32D)were significantly higher than those of the control group,in addition to TNF-α(P<0.01).The increase of CD69 in the Jak2v617f+SAA group(Jak2v617f+SAA serum+32D)was significantly higher than that in the control group (P<0.01),and there were no significant differences in comparing other serum cytokines levels of the Jak2v617f+SAA group and the control group(P>0.05).Compared with the control group,the other cytokines of AZD148(normal serum+ 32D+Jak2 inhibitor)excepted for CD69(P>0.05)increased(P<0.05，or P<0.01).Compared with the control group,CD69 of the SAA+AZD148 group(SAA serum+32D+Jak2 inhibitor)significantly increased(P<0.01),but the other cytokines significantly reduced(P<0.01).Conclusion Overexpression of mice 32D cells gene Jak2v617f can help make up for the consumption of SAA serum cytokines and mice 32D cells with Jak2 inhibitor are likely to increase the consumption of SAA serum cytokines.

[Key words]Jak2v617f;Transfection;SAA;Cytokine;AZD148

[中图分类号]R556.5

[文献标识码]A

[文章编号]1673-9701（2016）04-00019-06

[基金项目]广东省科技计划项目（2011B031800344）

收稿日期：（2015-11-27）