灵芝多糖的抑瘤作用及对小鼠免疫系统影响的实验研究∗

卢玉振， 李 祥， 周 磊(江苏省淮安市第二人民医院检验科， 江苏 淮安 223002)



灵芝多糖的抑瘤作用及对小鼠免疫系统影响的实验研究∗

卢玉振， 李 祥， 周 磊
(江苏省淮安市第二人民医院检验科， 江苏 淮安 223002)

摘 要:目的:探究分析灵芝多糖的抑制作用及其对小鼠免疫系统的影响。方法:随机选取95只小鼠并采用瘤细胞建立免疫抑制动物模型，将所选小鼠随机分为48例实验组和47例对照组，实验组小鼠采用灵芝多糖口服液灌注，对照组小鼠给予生理盐水灌注，观察并分析灵芝多糖对小鼠的存活期、抑瘤作用及免疫系统的影响作用。结果:实验组肿瘤小鼠的生存期明显高于对照组肿瘤小鼠(P＜0.05)，并且实验组小鼠血清中TNF-α、IL-2水平显著提高，其肿瘤细胞NK活性及淋巴细胞增生率也显著高于对照组(P＜0.05)。结论:灵芝多糖对小鼠肿瘤无直接抑制作用，其抗肿瘤功效主要是通过机体的免疫系统介导，并且灵芝多糖能够有效延长机体生存期。

关键词:灵芝多糖； 抑瘤作用； 免疫系统； 小鼠肿瘤

灵芝是我国中医学上的传统补益中药，属于灵芝属真菌，包括紫芝、白芝、赤芝、薄树芝等多种品种，其中以赤芝最为常见[1]。灵芝具有扶正固本、延年益寿、滋补强体等功效，主要活性成分包含三萜类、生物碱、多糖等，其中灵芝多糖是临床研究中发现的主要活性成分之一[2]。多项临床研究表明，灵芝多糖具有较好的抗肿瘤和免疫调节作用[3，4]。本研究通过建立实体移植瘤小鼠模型，进一步探究了灵芝多糖对小鼠肿瘤的抑制作用及其调节作用。现报告如下:

1　材料与方法

1.1主要实验材料与试剂:健康小鼠95只，鼠龄5～8周，体重16～24g，雌性小鼠47例，雄性小鼠48例。灵芝多糖从实验室研究用的灵芝菌丝体发酵液中提取；小鼠肿瘤细胞由微生物实验室提供；F1uka产PCH100电脑二氧化碳孵育培养箱，TNF-α、IL-2试剂盒由上海森雄科技实业有限公司生产，MTT、ConA，酶标仪由奥地利进口仪器。

1.2方 法

1.2.1肿瘤小鼠模型建立:由小鼠肿瘤菌株进行腹腔传代接种，按细胞数1×106/ mL，每只接种肉瘤细胞0. 2mL，小鼠腹腔注射，所选小鼠均按照常规方式进行饲养，24h后进行随机分组。

1.2.2生存期观察:实验组小鼠腹腔注射灵芝多糖，每天注射量1.0mg/ mL，连续腹腔注射一周；对照组小鼠按照同样方法、同等注射量注射无菌生理盐水，分别观察两组小鼠的生存期。

1.2.3免疫功能检测:两组小鼠在接种肿瘤细胞后第10天，分别取小鼠的眼球血，并离心血清处理，留取离心血备用，然后取小鼠脾进行免疫功能检测试验。①NK细胞杀伤活性检测:首先，将所取小鼠脾部在无菌环境下进行处理，分别制成单个细胞，并采用无菌水进行红细胞休克处理30s左右，并迅速加入等量的1.7%生理盐水进行等渗恢复；其次，采用锥虫蓝拒染计数活细胞，待活细胞计数达到95%以上既可以将其与YAC -1一起放置于培养板上进行MTT法检测小鼠的NK细胞活性。最后，采用96孔培养板用于检测细胞活性，各设置3个复孔，其中NK细胞活性的检测方式以靶细胞对照孔A值-实验孔A值和效应细胞孔A值，并除以靶细胞对照孔A值[5]。②淋巴细胞增生率的检测方式:将浓度为5×106/ mL的脾细胞加入培养孔中，每孔200uL左右，实验组和对照组的处理方式不同，实验组在每孔各加50uL/ mL的ConA20uL，对照组在每个培养孔中加入20uL培养液，并放置于37℃的二氧化碳孵育培养箱中进行培养。最后，离心培养液，并取100uL的上清液，采用MTT进行A值测定，并计算小鼠淋巴细胞的增生率，淋巴细胞的增生率以实验孔A值-对照孔A值再除以对照组孔A值进行测定[6]。③血清TNF-α水平测定:采用酶联免疫检测法及TNF-α试剂盒进行检测，根据标准测定A值绘制曲线，并从校正曲线上进行检测待检标本中TNF-α的水平。④血清IL-2测定:与血清TNF-α水平测定方式相同，在在酶联免疫检测法的基础上，采用IL -2ELISA试剂盒测定，并从校正A曲线上进行IL-2水平的检测。

1.3统计分析:采用SPSS18.0统计学软件进行统计学处理，两组小鼠的平均存活期、及血清中TNF-α、IL -2含量等指标检测结果采用±s来表示，组间数据比较采用t或t'检验，以P＜0.05表示具有统计学意义。

2　结 果

2.1两组小鼠的生存期比较:两组小鼠在接种肿瘤细胞后，其生存期表现出不同差异，其中实验组小鼠的存活期明显长于对照组，其平均存活期(44.2±12.7)d也显著多于对照组(27.7±10.5)d，两组对比具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1　两组肿瘤小鼠的存活期差异比较(±s，d)

表1　两组肿瘤小鼠的存活期差异比较(±s，d)

组别　例数　存活期　平均存活期对照组　47　10～56　27.7±10.5实验组　48　18～64　44.2±12.7

表2　两组小鼠TNF-α、IL-2水平的差异比较(±s，umoL/ L)

表2　两组小鼠TNF-α、IL-2水平的差异比较(±s，umoL/ L)

组别　例数　TNF-α　IL-2对照组　47　137.74±128.19 285.41±39.74实验组　48　225.06±87.36　401.53±77.93 t -18.83　22.09 P -0.17　0.01

表3　两组小鼠的肿瘤NK细胞活性及淋巴细胞增生差异比较(±s，%)

表3　两组小鼠的肿瘤NK细胞活性及淋巴细胞增生差异比较(±s，%)

组别　例数　NK活性　淋巴细胞增生对照组　47　51.32±8.74　55.29±7.42实验组　48　70.61±9.38　65.17±9.24 t -12.85　20.46 P -0.027　0.014

2.2两组小鼠血清TNF-α、IL-2含量比较:实验组小鼠血清中TNF-α(225.06±87.36)pg/ mL、IL-2水平(401.53±77.93)umoL/ L明显高于对照组，两组对比差异显著(P＜0.05)。见表2。

2.3两组小鼠的免疫指标比较:两组小鼠在分别经过灵芝多糖和生理盐水灌注后，其肿瘤NK细胞表现出不同的生理活性，淋巴细胞增生率也出现明显不同，两组对比差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

3　讨 论

灵芝在我国中草药应用上具有两千多年的历史，能够有效提高机体的非特异和特异免疫功能，临床研究显示，灵芝多糖能够明显抑制小鼠肿瘤的生长，能够促进机体免疫细胞因子的产生。肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病之一，具有较高的死亡率，对患者的生活质量造成了巨大影响。近年来，临床上对抗肿瘤的药物研究逐渐延伸到了从真菌及其代谢产物中进行有效活性成分的提取，灵芝作为我国传统应用的重要中草药之一，其中的灵芝多糖成分是灵芝的有效活性成分，通过提取灵芝菌丝体发酵液中的灵芝多糖，能够深入探究分析灵芝多糖对肿瘤小鼠免疫系统的影响。国内外多项临床研究显示，TNF-α、IL-2等细胞因子可以激活NK细胞，NK细胞在机体的肿瘤监视和防护中起着非常重要的作用，活化的NK细胞可以释放IFN-r、TNF-α、IL-2等细胞因子，调节巨噬细胞的作用，增强抗肿瘤效果。此外，灵芝多糖具有有效促进肿瘤小鼠淋巴细胞对ConA的增殖反应，说明灵芝多糖具有增强机体细胞免疫作用的功效。本研究的实验结果显示，采用灵芝多糖灌注的实验组小鼠其血清IL-2水平明显高于采用生理盐水灌注的对照组，说明灵芝多糖能够提高肿瘤小鼠血清中的IL-2含量，从而有效提高肿瘤小鼠的免疫功能。

参考文献:

[1] 赵树立，聂运中，梁桂宁，等.灵芝多糖联合低剂量顺铂抑瘤作用及对荷瘤鼠免疫功能的影响[J].国际中医中药杂志，2012，34(12)：1084～1087.

[2] Gao Y，Zhou S，Wen J，et a1.Mechanism of the antiu1cerogenic effect of Ganoderma 1ucidum po1ysaccharides on indomethacin-induced 1esions in the rat[J].Life Sciences，2002，72(6)：731～745.

[3] 吴先闯，杜钢军，郝海军，等.玉米须多糖对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用及其对小鼠免疫功能的影响[J].华西药学杂志，2015，30(1)：26～29.

[4] 卢见行，肖传，田华张，等.灵芝多糖GLP抑制小鼠骨肉瘤细胞S-180在体内生长的作用机制[J].现代生物医学进展，2012，12(2)：262～264.

[5] 崔永伟.灵芝多糖的急性毒性和抗肿瘤作用[J].中国当代医药，2012，19(2)：46～47.

[6] 贾靖，孙立新，葛志华，等.B16F10黑素瘤细胞培养上清对同基因小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用[J].河北医学，2010，16(7)：769～771.

Tumor Suppression Function and the Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharide on the Immune System of Mice

LU Yuzhen， LI Xiang， ZHOU Lei
(The Second People's Hospital of Huaian，Jiangsu Huaian 223002，China)

Abstract:Objective:To exp1ore the inhibition of ganoderma po1ysaccharides and its effects on the immune system of mice. Method: 95 mice were random1y se1ected and estab1ished the anima1 mode1 of immunosuppression by tumor ce11，then random1y divided into experimenta1 group (48 cases) and contro1 group (47 cases). The mice in the experimenta1 group were given ganoderma 1ucidum po1ysaccharide by ora1 1iquid infusion，whi1e the mice in the contro1 group were given sa1ine infusion，then the in1uemce of ganoderma 1ucidum po1ysaccharides on mice surviva1 time，tumor suppression effect and the immune system were observed and ana1yzed. Result: The surviva1 period of the experimenta1 mice in the experimenta1 group was obvious1y higher than that of the contro1 group (P＜0.05)，and serum TNF a1pha，IL - 2 1eve1s of mice in the experimenta1 group increased significant1y，the tumor ce11s，NK activity and 1ymphocyte pro1iferation rate was a1so significant1y higher than that of contro1 group (P＜0.05). Conclusion: Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide has no direct inhibitory effect on tumor in mice and its anti-tumor effect is main1y mediated by the immune system，and ganoderma 1ucidum po1ysaccharides can effective1y pro1ong thesurviva1. time.

Key words:Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide； Tumor suppression effect； The immune system；Tumors in mice

文献标识码:B

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.02.005

文章编号:1006-6233(2016)02-0190-03

基金项目：∗江苏省卫生厅科研基金项目，(编号：H201346)