朊病毒病生物标记microRNA-142-3p可视化快速检测

张腾龙，薄乐，英那，郝文丽，武智勇，王雄，孟轲音，万家余，陈志宝（.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆6339；.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所）



朊病毒病生物标记microRNA-142-3p可视化快速检测

张腾龙1，2，薄乐1，2，英那2，郝文丽1，武智勇1，王雄1，孟轲音2，万家余2，陈志宝1
（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319；2.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所）

摘要：为了更快捷、方便的检测朊病毒病，根据已有报道确定microRNA-144-3p作为朊病毒病的生物标记，通过miRBase数据库公布的microRNA-142-3p的核酸序列，设计特异性标记有生物素的俘获探针和标记有FAM的检测探针，从而建立了纳米金偶联核酸试纸条的高效，快捷，可视化检测方法。结果表明：该检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度（0.005 nmol·L-1）。该检测试纸条的建立在朊病毒病预防，控制，诊断过程中具有一定实际意义。

关键词：朊病毒；microRNA-142-3p；生物标记；可视化；检测

朊病毒病（prion disease）是一种致死性，传染性神经系统退行性疾病。该疾病变种较多，其中疯牛病已经打破中间屏障成为严重危害人类和动物健康人畜共患病之一[1]。目前普遍认为这类疾病的致病因子就是本体细胞中正常的朊蛋白（PrPC）发生结构错误折叠形成致病型蛋白（PrPSc），这种蛋白质具有极强的抗逆性，对较高的温度、强酸强碱、抗生素和干扰素、酶的耐受性很强。因此，它能在神经细胞中大量聚集沉淀、引起神经细胞代谢、调节紊乱、神经元空泡化大量死亡[2]。正是由于它抗逆性极强，同时也因为朊病毒病发病机理至今仍不清楚，朊病毒病尚未有效的预防和治疗措施[3]。人们普遍认为，人和动物体内存在某种因子对朊病毒感染、致病起着重要的调控作用，这种未知因子影响人们对朊病毒病发病机理的理解，朱淼等人利用模式动物-新秀丽线虫验证了铜离子对朊病毒病有一定的抑制作用[4]，当然科学家们也从来未停止对这种未知因子的探索。

由于这种疾病的高致病性、高致死率，对其的预防与检测也从来没有间断过。病理组织切片、酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点、Western Blotting和荧光定量PCR等技术提供了高亲和性、高灵敏性、高特异性的检测方法，但是这些检测方法需要很长的检测时间，专门的检测仪器、烦琐、复杂的检测程序并且要求要具有一定专业技能的人员操作，检测使用的材料价格昂贵，具有很强的局限性。因此，需要一种更简单、快速、可视化、成本低廉的检测方法。

随着科学工作者对这类疾病更深入的研究发现，一些小分子RNA表达情况与很多疾病相关，例如一些肝病、肾病、神经性疾病甚至癌症[5]，因此这类小分子RNA可以作为疾病诊断的生物标记。实验室通过构建感染羊瘙痒因子22L毒株的小鼠鼠脑microRNA芯片，结合荧光定量PCR对microRNA表达情况的分析发现，microRNA-142-3p表达量明显高于正常小鼠。因此，我们micoRNA-142-3p确定为朊病毒病发病的重要生物学标记（Biomarker）。通过制备特异性核酸试纸条检测朊病毒病相关生物学标记，从而间接检测朊病毒病。

1　材料与方法

1.1材料

颗粒直接为13 nm的纳米金溶液有中国科学院长春应用化学研究所惠赠。感染羊瘙痒因子22L毒株的小鼠神经瘤细胞（ScN2a）由军事医学科学院十一所空气生物学与呼吸道病原学实验室构建保存。microRNA-144-3p，俘获探针，检测探针（见表1）均委托上海生工生物公司合成，其中俘获探针使用生物素修饰，检测探针使用FAM修饰，PVDF膜。

1.2主要试剂与仪器

主要试剂：50 mM Na2HPO4┌0.5 M NaCl，pH 6.8；灭菌后，4℃保存。小牛血清和PVDF膜购自大连宝生公司（Takara），DEPC水，Trizol@Reagent。氯仿，异丙醇，无水乙醇，戊二醛购自与北京化工厂，生物素抗体和FAM抗体。

主要仪器：UMAX Powerlook扫描仪扫描。

表1　试验中所用microRNA以及探针序列Table 1microRNA and probe sequence in the test

1.3实验方法

1.3.1可视化核酸检测试纸条的制备

试纸条的制备参照杭州优思达公司徐高联等[6]的方法制备。吸取新制备的红色纳米金溶液2 mL于洁净的离心管中，1 000 rpm离心5分钟，弃去上层清液，加入1.5 mL去离子水将纳米金颗粒重悬，1 000 rpm离心1 min，该步骤重复一次。将收集的红色纳米金颗粒转移至新的洁净的离心管中，加入FAM抗体（10 mg·mL-1）的戊二醛缓冲溶液，20℃孵育3小时。然后8 000 rpm离心10 min，收集已经包被有抗生蛋白链菌素的纳米金颗粒并向其中加入羟胺，20℃孵育30 min后，将其锚定在结合板上。生物素抗体使用1×PBS缓冲溶液稀释，充分混匀后，均匀涂布一条线作为试纸条的检测线，将FAM溶解于1× PBS缓冲溶液中充分混匀后，涂布一条线作为试纸条的质控线。将试纸条放置在37℃烘箱内干燥2小时，然后按照5 mm×5 cm的规格剪成条状，并在试纸条靠近结合板一端贴点样板，内一端则粘贴吸水板。这样有利于反应产物快速流经PVDF膜，便于可视化检测。

1.3.2核酸杂交反应

将合成的检测探针和俘获探针经过短暂离心后，用已配置好的SPSC缓冲溶液稀释为成相应浓度，在此过程中应避光操作。将合成的microRNA-142-3p用SPSC缓冲溶液稀释备用。吸取10 μL俘获探针于洁净的200 μL离心管中，等体积加入不同浓度的microRNA-142-3p和检测探针，充分混匀后，95℃加热5分钟25℃孵育10分钟。反应产物用于核算试纸条检测。

1.3.3ScN2a细胞总RNA的提取

（1）取鉴定完毕且处于对数生长期的N2a细胞和ScN2a细胞，调整细胞浓度为6×105cell·mL-1，分别接种于6孔培养板中，待细胞贴壁长满后，用于提取细胞总RNA。

（2）每孔中加入1 mL Trizol试剂将对照组（N2a）和实验组（ScN2a）消化并转移到RNase-free的离心管中，激烈震荡15秒后，冰浴静置10 min。

（3）向离心管中加入200微升氯仿，反复颠倒混匀后，剧烈震荡20秒，冰浴静置10分钟，待混合液分层后，4℃，14 000 rpm离心15 min。

（4）离心后溶液分三层，小心吸取400 μL上层清液于新1.5 mL RNase-free的离心管中，向每管中加入500 μL异丙醇，剧烈震荡混合均匀，冰浴静置10 min后，4℃，14 000 rpm离心10 min。

（5）弃上层清液，使用洁净的滤纸吸去残余液体后，向每管中加入75%乙醇，反复颠倒漂洗，4℃，8 000 rpm离心15 min。重复此步骤两次。

（6）弃掉上清液，自然风干管内残余液体后，加入20～50 μL RNase-free water重新溶解，溶液即为细胞总RNA。

（7）对所提取的总RNA进行质量检测。

1.3.4利用核酸试纸条进行可视化检测

吸取10 μL反应产物滴加在试纸条的点样板上，随后向点样板滴加100 μL的runnin buffer，室温水平放置30 min内观察检测结果。

1.3.5灵敏度检测和特异性检测

特异性检测：我们选取了四种其他microRNA作为对照，通过上述方法，对其进行特异性评估。

灵敏性检测：将microRNA-142-3p稀释成不同的浓度，然后按照上述检测方法进行检测，确定该方法的灵敏性，无限降低靶标的浓度，确定该法的检测极限。

1.3.6对模拟样品的检测

使用Trizol试剂将贴壁的感染羊瘙痒因子22L毒株的小鼠神经瘤细胞（ScN2a）和正常小鼠神经瘤细胞（N2a）消化，沉淀，洗涤，溶解提取细胞总RNA，按照1.1.2和1.1.4中操作步骤进行检测。

1.3.7所有检测试纸条结果均通过UMAX Powerlook扫描仪扫描

2　实验结果

2.1特异性检测结果

实验选取五种不同的microRNA：microRNA-215，microRNA-122，microRNA-21，microRNA-448 和microRNA-142-3p按照上述方法进行检测，只有microRNA-144-3p和五种microRNA的混合溶液的检测结果呈阳性，其他四种microRNA的检测结果呈阴性（见图1），从而证明这种可视化检测方法具有较好的特异性。

图1　microRNA-3p-144特异性检测Fig.1Specific detection of target microRNA-142-3p

2.2灵敏性检测结果

试验将microRNA-142-3p稀释成为十一个浓度梯度，随着靶标浓度的降低，检测线的颜色也随之变浅。通过梯度降低靶标浓度，确定了该方法的检测极限为0.005 nM（见图2）

图2　目标microRNA-144-2p灵敏度检测Fig.2Sensitivity of detecting target microRNA-142-3p

2.3感染羊瘙痒因子22L毒株的ScN2a细胞检验

我们将提取ScN2a细胞总RNA稀释三个浓度梯度，作为模板，使用同样的复活探针和检测探针，按照1.3.1和1.3.3所示的核酸杂交与检测方法对细胞中microRNA-144-3p进行检测。检测结果显示：三个浓度梯度的总RNA检测结果呈阳性（见图3），其中原液检测线清晰，颜色较对照组明显加深。

图3　目标microRNA-144-3p的细胞模拟样本检验Fig.3 Mimetic cell samples test of target microRNA-144-3p

3　讨论

自从首例疯牛病于1986年在英国发现以来，已经多次引起了全球性威胁，对人类健康和经济发展造成了巨大损失并引发了许许多多的社会问题。有研究证明，疯牛病已经打破种间屏障，是一种高致病性，高致死率的人畜共患病，它的传播途径多样化，主要以食用感染疯牛病的肉制品在动物与人类之间传播，严重威胁食品卫生安全与人类健康。

microRNAs是内源性非编码约23个核苷酸长度的单链RNA分子[7-8]。miRNA在不同病理和生物过程，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化，心血管疾病，神经障碍性疾病以及癌症中发挥着重要的作用[9-10]。实验室通过基因芯片和荧光定量PCR的方法检测到microRNA-144p的表达量在正常小鼠和感染羊瘙痒病22L毒株的小鼠脑部表达具有非常显著的差异。因此，microRNA-142-3p可以作为检测朊病毒病的生物标记，所选取对照组均是与癌症或者神经退行性疾病相关并且非常常见的几种分子，它们的核酸序列较短，同目标microRNA分子序列相似，可以用于特异性检测的对照组。

实验通过建立快速，高效，低成本的可视化段片段核酸检测方法，针对microRNA-142-3p进行检测，发现感染22L毒株的神经瘤细胞中该分子的含量明显高于未感染的细胞，结果与廖翔宇[9]和刘志培[10]的基因芯片和荧光定量PCR趋势相符合。实验采用纳米金偶联核酸试纸条的方法，方便携带，更加快捷，而且所用材料本身对人体危害较小，具有安全实用的特点。由于细胞总RNA中包含RNA种类偏多，可能稍微会影响到检测结果的精确度，如何在实际肉质食品安全监测中得到较为单一的检测靶标仍然值得我们探索，其次就是单一寡居核酸检测确具有较高的灵敏度，为了达到为灵敏度和检测范围的更高要求，应该考虑到检测信号的扩大化以及针对多条变化趋势相同的核酸，这也作为实验室着力研究的重点。

4　结论

针对目标microRNA-142p设计相对特异性的俘获探针和检测探针，结合纳米金材料达到了可视化检测的目的，建立了比较灵敏，快捷，简单的检测方法。为预防，控制，诊断朊病毒病提供了有利参考。

参考文献：

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［5］Jin G，Sun J，Isaacs SD，et al.Human polymorphisms at long noncoding RNAs（lncRNAs）and association with prostate cancer risk［J］.Carcinogenesis，2011（32）：1655-1659.

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［10］刘志培，孟轲音，鞠传静，等.朊病毒病相关miRNA在不同发病脏器和细胞中表达的变化［J］.中国生物制品学杂志，2013，26（10）：1434-1444.

Visualized Detection of Prion Disease of Biomarker MicroRNA-14-3p

Zhang Tenglong1，2，Bo Le1，Ying Na2，Hao Wenli1，Wu Zhiyong1，Wang Xiong1，Meng Keyin2，Wan Jiayu2，Chen Zhibao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Institute of Military Veterinary，Academy of Military Medical Sciences）

Abstract:For the purpose of detecting prion disease more rapidly and conveniently，microRNA-144-3p has been considered as a biomarker for prion disease according to the pre-report.Based on miRBse sequence，the specific capture probe with marked biotin and detecting probe with marked FAM were designed in order to establish the high efficiency，rapid and visualized detection method，which coupled with nano-gold and nucleic indicator paper.Therefore，this method made a good foundation to prevent，control，diagnose prion diseases.

Key words：prion；microRNA-144-3p；biomarker；visualization；detection

中图分类号：S865.13

文献标识码：A

文章编号：1002-2090（2016）01-0064-04

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.014

收稿日期：2015-03-12

基金项目：国家自然科学基金（3120197）；国家自然科学基金（3120114）。

作者简介：张腾龙（1988-），男，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2012级硕士研究生。

通讯作者：陈志宝，男，教授，博士研究生导师，E-mail：chenzhibao 2000@sina.com。