水涝胁迫下欧李叶片内还原性糖的变化

李丽霞++程小爱++张海平

摘 要：为研究欧李叶片内水涝胁迫下还原性糖的变化，从事先准备好的欧李中取样，用硫酸-苯酚定糖法测定欧李叶片中还原性糖，与对照比较还原糖的变化。结果显示，欧李叶片内还原性糖含量在水涝胁迫下先增多，而后再减少。研究认为欧李叶片内还原性糖的变化，使欧李对水涝胁迫产生了抗性。

关键词： 欧李；水涝胁迫；硫酸苯酚法；还原性糖

中图分类号：S662.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.003

Changes of the Reducing Sugar in Prunus humilis Leaves under Waterlogging Stress

LI Lixia1， CHENG Xiaoai2， ZHANG Haiping1

（1.Dingxiang County State Forest of Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400，China； 2.Taigu County Agricultural Commission， Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The changes of the reducing sugar in leaves of Prunus humilis were studied. Reducing sugar was isolated from leaves of Prunus humilis， and changes of the reducing sugar was detected by the method of phenol- sulfuric acid in the waterlogging stress. The results showed that the content of the reducing sugar was increased in the early stage but decreased in the later during waterlogging stress. The changes of reducing sugar could reflect the physiological changes and this can provide theoretical basis for introducing the Prunus humilis.

Key words： Prunus humilis； waterlogging stress； phenol-sulfuric acid method； reducing sugar

随着全球气候不断上升，海啸、洪水等灾害的爆发频率不断增加，世界各国在防涝抗洪、水土保持等问题的研究上注入大量金钱和精力。我国一直以来都是个洪涝灾难比较严重的国家，有将近2/3的土地受到不同程度的涝害，严重影响我国国民的生活[1]。植物对水分的需求有一定的标准，水分过多或者过少都会对植物的新陈代谢、光合作用等造成一定的影响。植物过度地受到水涝胁迫，可能使其发芽率降低、生长不好，甚至烂苗[2]，并且水涝胁迫会严重影响植物的生长发育，使其遗传潜力难以发挥。水涝胁迫不但影响植物的产量，而且限制了植物的广泛分布。因而，开展植物水涝胁迫研究，可以了解和研究植物对水涝胁迫的响应机制，从而为合理选择性和定向培育耐涝新品种提供理论依据。

欧李（钙果）Prunus humilis Bunge. 属于蔷薇科，李属（Prunus.L），是中国特有的一个蔷薇科樱桃属灌木树种，野生地区主要包括中西部地区的山西、陕西、河北、内蒙以及东北等地。欧李（钙果）作为这种植物的专业名字是植物分类学家陈嵘先生命名的。

欧李（钙果）的推广发展前景好，作为我国特有的一个野生经济植物具备产业化开发潜力。人们对钙、对铁、对方便绿色饮料日渐增长的普遍需求，为欧李（钙果）深加工提供了极为广阔和可能的发展前景，给医疗保健和食品饮料业提供了无限的商机。在对欧李（钙果）研究时发现：欧李（钙果）果汁、果酒、果脯等消费必将普及且长久不衰；钙果的种仁具有消肿、利尿、通便的功能，是一种很好的药材，药材市场收购价格不扉，医药工业也可以进行加工；其果实中含有多种对人体有益的矿质元素，尤其是钙的含量比一般的水果高，为了突出其钙含量高的特点，便诞生了其商品名“钙果”。

中国中西部地区广大廉价的荒山荒坡，使好栽易活易结实的欧李（钙果）大面积种植成为可能，为其深加工提供了丰富的生产原料，同时，巨大的市场需求也给加工业注入了足够的动力，欧李（钙果）要产业化也将成为越来越多人士的共识。钙果的茎叶可以喂牛，可以利用其生物量大的特点，带动畜牧业的发展。相信我国在欧李（钙果）的规模发展之后，将会在欧李加工产业、医药工业、畜牧业及种苗业等方面形成系统产业化开发的良好局面。

在欧李等植物中，糖是一切物质代谢的基础，因此，本论文研究欧李（钙果）叶片内还原性糖的变化。在糖类中，能够还原斐林（H.von Fehling）试剂或托伦斯（B.Tollens）试剂的糖称为还原糖。所有的单糖（除二羟丙酮），不论醛糖还是酮糖，都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。斐林试剂是含Cu2+ 络合物的溶液，还原性糖被还原后得到砖红色Cu2O的沉淀。苯酚-硫酸法利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，它们都可以用来鉴定和测量还原性糖的含量，并且它们各有优缺点[3]。所以，分子结构中含有还原性基团（如游离醛基或游离酮基基）的糖，叫还原糖。还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等，都是光合作用的产物，是一切物质代谢的基础。研究表明，植物体内的还原性糖是植物进行呼吸、光合等能量交换和新陈代谢的物质基础，与植物的生长发育与抗性紧密相关[4]。近年来，学者对其在苗木水涝胁迫过程中所起的作用进行了研究：随着水涝胁迫的加深，花旗松、马尾松、北美乔松苗木针叶内还原性糖的含量呈上升趋势[5]；荔枝叶片内还原性糖含量增加[6]；通过多经济作物葡萄[7]、樱桃[8]、苹果[9]等树的研究表明，水涝胁迫能使还原性糖在植物体内积累，从而使植物在水涝胁迫下能够适应并产生抗性。

由于国内外很少对欧李这一经济植物进行研究，因此，笔者对欧李叶片在水涝胁迫下的还原性糖、可溶性蛋白、SOD、POD等的变化进行试验。硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法由于方法简单、快速，试验成本较低，且无需多糖纯品等优点被广泛采用。本试验采用硫酸-苯酚法。传统的硫酸-苯酚定糖法中，由于平行样板间的吸光度值相差太大，使其检测的结果重现性和准确性较差，也容易出现误差，因此，用改进的硫酸-苯酚定糖法[10]。苯酚-硫酸法是利用硫酸在高温下使多糖水解并形成糖醛，糖醛在与苯酚形成稳定的显色，生成橙黄色化合物[11]，然后再以比色法测定。测定的还原性糖吸光度OD值，再通过硫酸-苯酚定糖法测定还原性糖的标准曲线差的还原性糖的含量，就可以计算出水涝条件下欧李叶片内还原性糖的变化。

1 材料和方法

1.1 试验样品

盆栽欧李（成都大学提供）10株，均分成试验组和对照组2组，试验组水涝胁迫（双套盆法），对照组空白对照，放置于实验室向阳处。

1.2 试验仪器和药品

7200可见分光光度计。蔗糖、硫酸、苯酚均为分析纯。

1.3 试验试剂的配制

（1）100 μg·L-1蔗糖标准溶液的配制。精密称取蔗糖（105 ℃干燥至恒质量）0.05 g，加入蒸馏水溶解，用蒸馏水定容于500 mL容量瓶中，备用。（2）显色液的配制。将50 mL浓硫酸缓缓加入蒸馏水中，冷却至室温，加入0.6 g苯酚晶体使其溶解配成显色液。然后置于锥形瓶中，备用。

1.4 还原性糖的提取

（1）样品处理。将10颗盆栽欧李平均分成两组：一组根全部浸入水中，编号为试验组；一组放入正常条件下，编号为对照组，将其放入实验室向阳处。24 h后开始取材，摘取试验组的欧李叶片用剪刀粉碎混匀，精确称取0.1～0.3 g（精确到0.000 1 g）3份样品分别装入试管中，编号为1、2、3；用同样的方法摘取对照组的欧李叶片，粉碎混匀，称取0.1～0.3 g 3份分别装入试管中，编号为4、5、6。

（2）还原性糖的提取。于上述的试管中加入2～3 mL蒸馏水，用封袋封住试管口，放入水浴锅内蒸馏45 min后，放入冷水浴中冷却至室温，用漏斗过滤，分别收集滤液于25 mL锥形瓶中编号为1、2、3、4、5、6重复此操作3次。将3次得到的编号分别位1、2、3、4、5、6中的漏液收集，定容于25 mL容量瓶并编号为1、2、3、4、5、6，制成待测液，备用。

1.5 还原性糖的显色

（1）还原性糖的显色处理。另取6只试管，编号为7、8、9、10、11、12。再从编号1、2、3、4、5、6容量瓶取0.05 mL样品待测液，分别加入试管7、8、9、10、11、12中。再于试管中加入0.25 mL显色液，振荡混匀后，放入沸水浴中保温30～35 min，再放入冷水浴中冷却至室温，备用。

（2） 测定还原性糖的吸光度OD值。将试管7、8、9、10、11、12中的样品待测液，用490 nm分光光度计测定其吸光度OD值，并记录数据。

1.6 计算方法

利用M=（C×V）/（W×106）×100%，可以计算出欧李叶片中可溶性糖的含量百分比。式中V为样品待测液的总体积；C为样品提取液的还原性糖的密度；W为植物鲜质量；M为可溶性糖含量的百分比。

2 结果与分析

2.1 硫酸-苯酚定糖法测定还原性糖的结果

按表1制作还原性糖的标准曲线，结果如图1。试验测得欧李叶片内还原性糖的变化如表2。

试验期间阳光等其它不定因素的变化如表3。

2.2 欧李叶片中还原糖的含量变化

通过试验测得欧李叶片吸光度OD值，从图1的标准曲线中查得欧李叶片的还原性糖含量，统计得欧李叶片内还原糖的含量百分比M的变化。从图2中可以看出：（1）试验开始的72 h试验组欧李叶片内还原性糖百分含量分别是13.67%，40.24%，26.95%，而对照组欧李叶片内还原性糖的百分含量分别是26.13%，27.42%，31.33%，即试验组欧李叶片的含糖百分比先增加然后减少，而对照组欧李叶片的含糖百分比几乎不变；（2）试验开始后72 h试验组欧李叶片内还原性糖的百分含量分别是30.72%，38.26%，37.13%，而对照组欧李叶片内还原糖百分含量分别为30.70%，44.56%，39.79%，可以看出试验组和对照组都发生了变化，且变化状况都相似，即试验组和对照组欧李叶片中的含糖百分比都是先增加再减少。

3 结论与讨论

从结果分析中知，试验的前期阶段在未受到阳光等环境因素影响下，水涝胁迫引起的欧李叶片内淀粉减少，还原性糖增加，其主要生理作用是还原性糖参加欧李叶片内渗透调节[12-13]。植物的渗透作用使欧李等植物适应环境，增强抗逆性的基础[14]。还原性糖增加的主要原因有几点。（1）欧李在水涝胁迫下，使根缺氧，根缺氧会影响叶片的光合作用，这首先导致叶片气孔关闭，增大CO2向叶片扩散的阻力，继而影响相关酶的活性[15-17]。（2）淀粉等糖的主动水解，以维持树木、叶片等体内的渗透势，保持其生理代谢功能的正常进行。（3）水涝对植物造成胁迫，使可溶性糖不能被光合作用正常利用，造成可溶性糖的积累[15]。研究表明，还原性糖的积累是反抗水涝胁迫的有效指标之一[16]。

在水涝胁迫下，欧李叶片内还原性糖先增加后减少，可以看出植物对水涝胁迫的适应性。植物对水涝胁迫的适应性——抗性，有两种方式。（1）避逆性：植物在水涝胁迫中，能够建立起某种屏障，完全或者部分阻止胁迫因子进入它的内部，以避免胁迫因子对它造成伤害。（2）耐逆性：植物在水涝胁迫中，能够完全或者部分忍受胁迫因子对它造成的伤害，而不至于受到胁迫的伤害，或引起比较小的伤害[17]。

在水涝胁迫下，可使欧李发生生理和结构的变化，得出植物对水涝胁迫的耐性。（1）水涝胁迫下，植物由于缺氧其呼吸代谢以乙醇发酵为主，中间产物乙醛和末端产物乙醇过多积累对细胞产生毒素，一些植物可以通过其它代谢途径，如苹果酸发酵、乳酸发酵等代替乙醇发酵，减少乙醛、乙醇等积累以减少伤害，适应缺氧环境[18-21]。（2）水涝胁迫下，一些对水涝胁迫敏感的植物的无氧呼吸加强，有氧呼吸下降，有氧呼吸的场所中线粒体结构发生显著的变化，内膜消失，内膜脊肿胀，形状不规则。（3）水涝胁迫下，一些对水涝适应较好的植物，一方面可以加快体内乙烯的合成，另一方面在体内扩散能力减少。与此同时，土壤厌氧微生物释放的乙烯被植物吸收，而乙烯对植物没有毒害作用，反而可以增加植物适应水涝环境。（4）水涝胁迫下，有些植物的某些基因才能够完全表达，这能够使植物适应水涝环境[17]。

试验后期阶段，由于欧李受到阳光等不定因素变化的影响，使其叶片内还原性糖变化受到影响。由于阳光等的变弱，使叶片的蒸腾作用减弱，叶片气孔关闭，光合作用减弱，叶片为了维持其渗透势，加快多糖等的水解，使还原性糖增加。

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