有机肥料对土壤微生物多样性影响研究进展

王靖渊　屠乃美　何康　侯方舟　付小红　杨旭初

摘 要：主要介绍了传统法、BIOLOG法、磷脂脂肪酸（PLFA）法、PCR分析法进行土壤微生物多样性分析的优缺点，阐述了有机肥概念，综述了有机肥对土壤微生物多样性的影响。指出施用有机肥对微生物多样性的不同影响， 合理配施有机肥对于土壤微生物数量、结构和组成都有影响，有助于降低作物发病率，同时能够有效提高作物产量和产值。文章还针对当前研究的方法和探索的方向进行了归纳和总结，对今后有机肥关于微生物的研究方向进行了展望。

关键词：有机肥；微生物；多样性

中图分类号：S143.6 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.012

Effect of Organic Fertilizer on Soil Microbial Diversity Progress

WANG Jingyuan1，2， TU Naimei2， HE Kang1，2， HOU Fangzhou1，2， FU Xiaohong1，2， YANG Xuchu1，2

（1.College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China； 2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Multi-cropping Cultivation and Farming System， Changsha， Hunan 410128， China）

Abstract： This paper described the advantages and disadvantages of several soil microbial diversity analysis methods conducted by conventional methods， BIOLOG law， PLFA and PCR. Described the influences of organic fertilizeron soil microbial diversity. And pointed out the effect of organic fertilizer application on the microbial diversity soil microorganisms， reduced the incidence of crops and improve crop yields. Problems of current researches and future research directions were suggested.

Key words： organic fertilizer； microorganisms； diversity

土壤微生物是土壤有机质和养分转化、循环的动力，是土壤具有生命力的标志性特征，与土壤健康和肥力有着密切关系，对周围环境的变化做出迅速反应，在土壤不断的形成、发育、能量传递和物质转换过程中发挥着非常重要的作用，是目前评价土壤质量的重要指标，对自然元素循环具有重要意义[1]。随着近年来，人口的急速增加、自然环境和资源的过度开发使用、环境问题的加剧和外来生物物种的入侵，使得土壤微生物多样性受到了强烈的影响和干扰[2-4]。多层次的深入研究土壤微生物多样性能有助于了解土壤目前的状况，并以此为基础制定生态环境保护、自然资源合理利用的措施。随着研究技术的更新和完善，微生物多样性研究方法和层次都得到了大幅度提升和改善， 有关土壤微生物多样性的研究方向和角度愈发深入[5-6]。本文在前人研究的基础上重点探讨了目前较为常见的几种土壤微生物多样性的研究方法，以及施用有机肥对土壤微生物多样性影响的研究进展。

1 土壤微生物多样性主要分析方法

传统微生物多样性的研究分析方法的原理是根据已知的目标微生物特性来选择合适的培养基进行实验培养，然后通过对各种微生物在培养期间的生理生化特征和外观形态不同的变化进行区分鉴定。利于衡量小型微生物群体的多样性，其优点是简便快捷。但是由于技术条件的限定，常导致微生物富集生长，且反映的微生物信息有限，误差大[7-9]。

BIOLOG系统是研究土壤微生物功能多样性和群落结果的方法。所运用的原理是接种经过稀释的土壤菌悬液后，根据土壤中不同的微生物对单一碳源底物的利用所呈现出的能力差异， 让氧化反应指示四唑类显色物质呈现出不同程度的紫色， 构成该微生物的特定指纹。运用特有的排列显型技术通过配套的BIOLOG软件进行比较分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱，与标准菌种的数据库比较之后反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化[10]。与传统的平板培养法相比，BIOLOG碳源利用法有固定碳源，无需配置微生物培养基，方便、高效、分辨力强、灵敏度高、易于测定等优点，但是由于培养环境的改变和标准数据库的不健全，所以存在误差和有些种类不能鉴定的问题[11]。

PLFA分析法是一种通过磷脂脂肪酸含量和组成，表征土壤微生物在数量上具有优势的群落，并且可以快速有效的重现土壤微生物群落结构，分析微生物多样性的方法。其原理是利用死亡的细胞在降解分离时所形成的不同磷脂脂肪酸的比例、组成和种类，进而判断微生物种类，确定微生物群落多样性[12]。相对于传统微生物学方法，PLFA法直接提取原位上所需要测定的土壤微生物群落细胞中磷脂脂肪酸，避免了传统微生物学方法直接通过培养和计数方法所引起的实验误差，测定土壤微生物的生物量更准确有效，能精准快速的处理大量土壤样品。PLFA图谱可用于研究微生物的群落结构和微生物代谢条件。PLFA法可测定土壤微生物总量和特殊功能的菌群生物量，比传统法的检测范围更广。当然，该方法在应用中也有不足之处：首先，土样中的生物特征脂肪酸尚未建设完全；其次PLFA法尚不能在菌种和菌株水平上鉴定出微生物的种类；第三，PLFA的提取过程易受外界水热光照等因素的干扰；第四，由于不饱和脂肪酸会与氧气反应发生自氧化作用而挥发，导致被分析样品不易保存[13]。endprint

PCR（Polymerase Chain Reaction）技术反应类型是聚合酶链式反应，是一种细胞在体外通过扩增核酸序列从而可以得到多个核酸的技术，在分析扩增土壤微生物DNA常用这种技术，并且可以对土壤微生物DNA进行有效的数据定量或定性的分析。目前实验所常采用的PCR分析处理方法主要有：变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库法、核糖体基因间区分析（RISA）、限制性片段长度多态性技术（RFLP）、末端限制性片段长度多态技术（T-RFLP）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）等。PCR法优点：不受环境的影响和基因是否表达的限制；无需其他特殊材料，所测得的等位位点变异水平比其表型更为丰富；测得的数量很大，几乎遍及所有的基因组；标记的多数分子表现为共显性，能够很准确的分辨几乎所有的基因型。综合以上优点，PCR法在土壤微生物研究得到广泛的运用。但PCR法多适用于原核生物；实验条件要求高，技术分析所需要的成本高、分析费时。在土壤微生物的总DNA提取过程当中，由于其他物质干扰和DNA不稳定，很容易呈假阳性或PCR扩增失败。使得PCR法在微生物定量分析和种类鉴别等方面也存在不足[14-15]。

针对上述方法所存在的不足和缺陷，许多研究者在前期的实验操作和后期的数据处理时都做了大量的尝试和努力。让数据的呈现更直观精准，处理间的差异性更明显，实验的成本更低。

席劲瑛等[ 16]通过定义一个与 Biolog 微孔板相对应的网格图，使生物群落代谢信息更直观、快速、有效。谭兆赞等[17]通过利用多种数学方法，优化了Biolog方法的碳源设计，从 31 种碳源中筛选10 种特征碳源，使土壤微生物群落功能特征变化更准确有效。。Haack等[18]在简单采用PLFA方法提取磷脂脂肪酸的基础上，同时结合MIDI方法来提取和分析细胞中的磷脂脂肪酸，最后用开发商所提供的MIDI自动程序软件进行磷脂脂肪酸分析。。樊晓刚等[19]为找出最佳提取DNA方法，对比采用了手提和试剂盒两种提取方法，通过检验这两种提取方式PCR结果，最终确定最优条件；同时采用双梯度凝胶电泳，提高了实验准确性，降低了成本。

每种方法涉及的实验原理不同，所呈现出的精度、范围和准确性都会有所差异，如Oka等[20]在采用 PLFA和BIOLOG两种方法分别对一些微生物进行识别时，发现这两种方法具有错误辨识。

为了客观全面的评价微生物多样性，更真实的反映微生物群落数量、功能和结构的变化，将多种技术和方法相结合成为了一条新的思路。

Bodelier等[21]综合利用了PCR-DGGE和PLFA两种方法，分析研究了水稻土壤中的甲烷氧化菌群落结构。Ross等[22]采用了核酸和BIOLOG相结合的方法，对地下水中的微生物遗传多样性和代谢多样性进行了研究。Ibekwe等[23]在研究不同种植条件下，土壤微生物群落结构时发现：PLFA方法和 BIOLOG方法测得结果基本一致，但PLFA方法在检测时更加灵敏一些。Yao等[24]在研究和评价不同肥力与不同耕种历史的红壤中微生物群落结构差异时，总结出了和Ibekwe相同的结论。邢华铭等[25]分析比较BIOLOG和PCR-DGGE两种技术方法，得出BIOLOG得到的数据变化范围更大，而PCR-DGGE技术在对微生物结构和组成方面显得更敏感，所得信息多，偏差小。Widmer 等[26]对使用过杀虫剂的土壤分别用DNA、PLFA、BIOLOG3种方法分别检测同一实验处理的土壤微生物，发现所采用的这三种方法处理间的重复性都很好，能很好检测出不同处理与处理间的土壤差异性，但进一步分析发现不同方法处理的测定结果相似性有差异。

因此，在实验实施前，根据需要设计，在有技术和条件的情况下对样品进行多次的实验，对不同方法进行比较和分析，以求所得数据更全面客观的体现环境微生物多样性的变化，从而弥补单一方法分析微生物多样性所带来的单一和不足。

2 有机肥对微生物的影响

有机肥料是指以有机物为主的自然肥料，多是人和动物的粪便以及动植物残体，一般分为农家肥、绿肥和腐殖酸肥三类。研究表明，有机肥能提高土壤中有机质含量，增加农作物产量，改善作物的品质[27-29]。微生物性状常被人们认为是衡量土壤中分解有机质的重要参数，微生物直接参与土壤中有机质的分解，对土壤中的养分转化、循环、吸收起着至关重要的作用。微生物数量不仅推动着土壤中营养与养分的转化，同时还调控着土壤中物质能量流动、养分循环。土壤中有机物质是土壤微生物的营养和能量的源泉，长期施用有机肥可以提高土壤中微生物数量、生物活性和功能多样性[30-31]。土壤微生物数量、结构和组成的变化在一定程度上影响着土壤质量和植物的健康生长。土壤微生物多样性研究主要从遗传 、种类和生态系统3个层面展开。土壤微生物多样性是衡量土壤微生物群落结构稳定性的重要指标，反应了土壤生态和土壤胁迫对微生物群落的影响[32]。目前研究者关于有机肥对微生物多样性的研究重点主要侧重在三个方面。

2.1 传统有机肥

传统有机肥料是否对作物的生长，根系的伸长，作物对营养成分的吸收和微生物的数量，生物活性产生影响。张晓海等[33]在研究菜籽饼对烟田和烟地烤烟根际土壤微生物时发现，施用菜籽饼肥能增加土壤中细菌数量，且随着施入量的加大而增多。在烤烟生长中后期根际土壤解磷细菌、解钾细菌的数量增长很大，硝化细菌的数量有所提高。郭利等[34]通过比较微生物多样性指数H、均匀度E发现施用有机肥能促进烤烟根系的伸长，提高微生物数量，促进作物生长。杨宇虹等[35]对比研究了腐熟猪粪、腐熟秸杆和菜籽饼对烟田微生物数量影响，指出土壤中真菌、细菌和放线菌的数值均有提高，但因养分释放程度不同，对总量和高峰持续的时间均有影响。于树等[36]与Dick[37]研究表明，施用厩肥和绿肥等有机肥都有利于维持或增加微生物的数量和活性，且有机肥和无机肥配施效果更明显。李自刚等人[38]和肖嫩群等人[39]的研究均发现稻草还田能提高土壤中好气性微生物的数量。还田初期能够提高土壤微生物活性，显著提高土壤微生物数量和含量。endprint

2.2 新型有机肥

根据实际生产需要，在传统有机肥的基础上加入生物菌类，以提高有机肥的腐解程度，尽可能的让有机肥腐解释放养分的周期和作物生长周期相一致，从而在改善土壤理化条件的同时提高作物产质量，达到最大经济效益。胡可等[40] 利用BILOG ECO板和传统平板计数法，对不同微生物不同碳源底物的研究发现，生物有机肥可提高微生物的数量、活性和对不同碳源底物的利用率。加强了微生物代谢，活化了原有的微生物种群，提高了土壤微生物多样性。李北齐等[41]研究生物有机肥对玉米根际的真菌、细菌数量的影响，结果表明施用生物有机肥的处理真菌数量减少，但能增加根际土壤微生物的数量。刘剑君等人[42]通过在烤烟移栽时施入固氮菌 N05 制成的菌肥，同时配施80%氮肥和全量施氮肥，烤烟固氮菌的平均数量提高3.6倍，放线菌数量降低，呈显著性差异。除 Mg 元素有效性有所降低外，其他主要矿质元素有效性均有所增加。

2.3 将有机肥对土壤微生物多样性的变化规律与作物的发病率结合起来

通过对土壤微生物的种类、数量变化动态和生物学特性的研究，了解作物发病的机理，改善和降低作物的发病率，提高作物产量和经济效益。Yoshiko等[43]通过根际微生物对BIOLOG板固定碳源利用率的研究发现，番茄青枯病菌在一定程度上与土壤根际微生物存在一定的碳源竞争，土壤根际微生物在一定程度上能够有效抑制青枯病菌的生长。据徐华勤等[44]和孔维栋等[45]研究结果表明，施用有机肥能够调控土壤微生物群落结构和活性，在一定程度上降低土壤中微生物群落的均匀度，通过改良土壤环境来抑制青枯病。这可能是土壤中含有的有机质量增高，使得土壤中根际微生物的种群优势明显，导致劣势种群竞争性进一步减弱，从而有可能导致了劣势种群的逐渐消失，最终结果是使原有土壤中微生物多样性有所降低[46]。

3 展 望

随着人们对有机肥对微生物多样性影响的研究不断深入 ，今后的研究工作将主要集中在以下几个方面。

3.1 研究方法的选取

根据不同方法的原理、范围、精度，通过对试验的进一步对比和深入研究，找出合适的试验方法。在分析有机肥对土壤微生物多样性的影响时，使用一种方法所得到的数据具有局限性，在实际操作运用中，可以尝试两种或两种以上的方法，进行多维度，多水平上的测试，使得所得数据更全面、具体、精确。另外，在对实验结果进行分析的时候，采用多元统计方法或者专门的分析软件。

3.2 研究方向的改进

目前的主要研究方向主要停留在有机肥料是否对土壤微生物多样性有影响，以及微生物数量的变化（主要是细菌、真菌、放线菌），却对有机肥如何作用土壤微生物的机理研究甚少。目前研究的重点在有机肥对微生物的物种多样性和生态多样性，而缺乏对生理多样性和遗传多样性研究。有机肥短时间内对土壤微生物影响有限，但通过长期的定点试验发现，有机肥对土壤理化性质和微生物多样性均有明显的影响。但长期施用有机肥对土壤微生物多样性、微生态环境的影响和机理、以及土壤微生物对土壤生态系统功能调控机理的研究较少。

3.3 结合环境因素分析有机肥对微生物多样性的影响

环境对有机肥料的影响研究甚少，环境因素（如光，温度，水）能影响有机肥的腐解速率和程度。相同的有机肥在不同的地区因气候和环境的不同对土壤微生物多样性和植株的生长影响差异很大。如笔者在研究时发现，南方地区在烤烟移栽前，穴施的固体有机肥比浇施的液体有机肥效果会好很多，因为南方3—4月潮湿多雨，浇施的液体肥料易随雨水的冲刷而流失，从而造成有机肥对微生物多样性的影响变小，而穴施的固体有机肥受雨水影响较小。

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