精子形态可否预测精子其他参数和受精结局

戢开丽 郭江华 梁辉洪 关艺青 娄 娟江门市中心医院生殖医学中心（广东江门 529030）



精子形态可否预测精子其他参数和受精结局

戢开丽 郭江华 梁辉洪 关艺青 娄 娟
江门市中心医院生殖医学中心（广东江门 529030）

摘要目的 探讨精子形态在辅助生殖治疗中对选择授精方法时有否预测价值和意义。方法 回顾性分析2012年6月至2015年2月接受辅助生殖治疗的1 951周期患者精液资料，根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）精子正常形态率参考值下限为4%，将患者的精子正常形态率分成3组：A组＜1.0% 470周期，B组1%～4% 562周期，C组≥4% 919周期，分别采用常规体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）以及IVF受精失败后补救ICSI（RICSI）授精方式，比较3组精子正常形态与其他精液参数相关性，与授精方式、受精率、优质胚胎率的关系。结果 除了顶体酶外，精子浓度、活力、前向运动率、DNA完整率在3组形态间都差异极显著（P＜0.01），而且它们与精子正常形态呈显著的正相关；授精方式上3组的IVF比例分别是72.3%、86.7%、96.8%，ICSI组27.7%、13.3%、3.2%，3组间授精方式差异极显著（P＜0.01），RICSI比例也随着精子正常形态率升高而降低；受精结局上，只有IVF组3组形态间受精率（67.0%、70.0%和79.6%）差异极显著（P＜0.01），且和精子正常形态率趋势一致；胚胎质量反映在不同授精方式上趋势各有不同。结论 精子正常形态与其他大部分的精液参数有正相关性，影响IVF的受精率，故在辅助生殖治疗中对授精方式选择有一定指导意义。

关键词受精,体外;精子形态;DNA完整率;受精率

Key woorrddss Fertilization In Vitro;sperm morphology;DNA integrity;fertilization rate

近年来受环境和社会压力等影响男性的生殖健康呈下降趋势，据统计全球约有10%～15%的不孕不育夫妇，其中近一半是男性因素导致不育，需要寻求辅助生殖技术帮助。在辅助生殖治疗的过程中，精子与卵子结合是一个复杂的过程，影响因素很多，其中精子形态对受精率的影响一直存在着争议。2010年《WHO人类精液检查与处理实验室手册（第五版）》[1]（以下简称WHO第五版）将精子正常形态率的参考值下限从第四版的15%下调至4%，这个重大的变化让我们重新审视精子正常形态对生育力的预测。精子正常形态率低是否影响体外受精（In vitro fertilization，IVF）受精率呢？是否需要把精子正常形态作为卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）的指征？目前有关精子形态相关的报道[2-7]大部分是遵循WHO第四版手册的分类标准。本文根据WHO第五版精子正常形态率4%的参考值下限，将精子正常形态率分为3组：＜1.0%， 1%～4%和≥4%，以探索精子形态是否可预测精子功能和辅助生殖技术（ART）治疗的受精结局。

材料与方法

一、对象与分组

选择江门市中心医院生殖中心2012年6月至2015 年2月接受ART治疗1951周期，其中IVF治疗的夫妇1 717 周期，ICSI治疗的夫妇234周期，入选条件女方≤35岁，并排除全卵不熟和透明带异常的周期。女方平均年龄（30.3±3.1）岁，男方平均年龄（32.9±4.1）岁。平均不育年限（4.1±2.7）年，其中原发不孕1173周期，继发不孕778周期。按患者的精子正常形态率分成3组：A组 ＜1.0% 470周期，B组1%～4% 562周期，C组≥4% 919周期，分别采用常规IVF或ICSI授精方式。

二、方法

（一）促排卵方案

促排卵采用长方案、短方案、拮抗剂方案等，卵泡发育成熟后，注射HCG 5 000～ 10 000IU，于35～36h在超声引导下经阴道穿刺取卵。

（二）精液分析及处理

禁欲3～7d，手淫法获取精液，按照WHO第五版操作程序，对原始精液标本进行精子的浓度、活率、顶体酶、DNA完整率等常规检查和改良巴氏染色法精子形态学检查。正常形态的精子是头部光滑呈椭圆形，顶体占40%～70%；中段细长规则，长度与头部相等；主段比中段细，长约45μm[1]。精子正常形态率≥4%为形态正常的精子，2%～4%为轻度畸形精子，1～2%为中度畸形精子，＜1%重度畸形精子。

取卵日，精子浓度≤1×106/mL或活力＜10%行ICSI，否则行IVF授精。精液采用密度梯度离心+上游法处理，调整精子浓度为1×106/mL进行IVF授精。若处理后浓度低于0.2×106/mL，则改行ICSI。

（三）体外受精与胚胎移植

常规IVF：取卵后2～4h将卵冠丘复合体加入含精子的100μL受精滴中，3～4h后去除颗粒细胞，观察卵子的第二极体排出情况以确定是否受精，如果疑似双极体（2pb）≤25%，则行补救ICSI（Rescue ICSI，RICSI）。然后转移到卵裂期胚胎培养液中，置于6%CO2、37℃培养箱培养，试剂采用Quinn’s Advantage序贯培养基（SAGE，美国）。

ICSI：取卵后4～5h将卵冠丘复合体放在80IU/mL透明质酸酶（SAGE，美国）消化30～60s，然后用拆卵针去除颗粒细胞，在显微操作仪中行ICSI操作。

授精后16～18h观察原核，见双原核（2PN）为正常受精，第二天、第三天观察胚胎发育，根据发育速度、卵裂球大小均匀及碎片等情况评估胚胎质量。第三天胚胎细胞数在6～9个，碎片≤25%且均一或相对均匀的为优质胚胎。选择第三天细胞数多且碎片少的胚胎进行移植。

三、统计学方法

用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析、x2检验和相关性分析，P＜0.05表示差异具统计学意义。

结 果

一、我院精子正常形态率百分位数分布

从表1中可见，我院患者群体的精子正常形态率检查结果低于WHO第五版的调查数据。

表1　 我院精子正常形态率百分位数与WWHHOO第五版比较

二、3组患者的基本情况比较

对A组、B组、C组的女方年龄、男方年龄、不孕年限、基础FSH值、基础窦卵泡数和获卵数等基本情况进行比较，3组间均无显著差异（P＞0.05）（表2）。

表2　 3组患者的基本情况比较

三、3组患者的精液常规比较和相关性分析

A组、B组、C组3组形态的精液常规比较， 各组间浓度、活力、前向运动率、顶体酶、DNA完整率均差异显著（P＜0.01）；而且除了顶体酶外，随着精子正常形态率的升高，其他精液参数都呈上升趋势。精子正常形态与其他精液参数的相关性分析也发现，除了顶体酶外，都呈现正相关，（表3）。

四、3组患者的授精方式比较

3组间IVF和ICSI的授精方式差异显著（P＜0.01），随着精子正常形态率的升高，ICSI比例逐渐降低，A 组ICSI比例27.7%最高，C组极少部分行ICSI，只有3.2%。RICSI授精方式中，其比例也随着正常形态率升高而降低，（表4）。

表3　 3组形态患者的精液常规比较和相关性分析

表4　 3组患者的授精方式比较

五、3组形态患者受精结局和胚胎质量比较

在IVF组中，3组间受精率差异极显著（P＜0.01），随着精子正常形态率的升高，受精率也逐渐提高，卵裂率差异不显著，优质胚胎率差异极显著（P＜0.01），但其趋势与精子正常形态相反。在ICSI组中，3组间受精率差异显著（P＜0.05），但受精率与精子正常形态率的趋势不一致，卵裂率和优质胚胎率都差异不显著（P＞0.05）。在RICSI组中，3组间的受精率和优质胚胎率都差异不显著（P＞0.05），（表5）。

表5　 3组患者受精结局和胚胎质量比较

讨 论

受精过程中精卵结合是一个复杂的过程，包括卵母细胞成熟、精子成熟、精子获能、精子穿过透明带、配子融合、卵子激活等等，任何一个环节出错都可能导致受精失败。在许多受精失败的案例里，有时我们很难判定是卵子还是精子的原因。Ombelet等[8]认为精子形态对精卵结合很重要，但一旦精子到达卵胞质就失去预测的价值了，他还建议精确和严格的精子形态检查对受精潜能是有预测价值的。这符合WHO第五版对精子形态正常率的修订。但迄今为止，精子形态的预测作用仍存在争议，许多研究[2-4,9-11]表明精子形态是影响IVF结局的一个重要指标，而有些研究[7,12-13]又认为精子形态既不影响受精率也不影响妊娠结局。

本研究结果显示精子形态影响其他大部分精液常规的参数，如精子浓度、活力、前向运动率、DNA完整率等，精子正常形态率与它们都呈显著的正相关。Gandini 等[14]也认为形态缺陷伴有DNA碎片的增加。正因为如此，3组精子形态的ICSI比例、RICSI比例也随着精子正常形态率升高而逐渐下降。IVF组中，3组间受精率差异显著（P＜0.01），并且随着精子正常形态率的升高而上升，说明精子形态一定程度上影响IVF的受精（其结果与大部分报道[2-5,11]一致）。而在ICSI组中，3组间受精率虽然差异显著（P＜0.05），但与精子正常形态率的趋势不一致，这可能是3组间ICSI的样本量差异有关，在C组中，ICSI比例只有3.2%（29周期），而A组ICSI比例是27.7%（130周期）。另外Li等[11]认为胚胎学家在显微镜下尽可能选择看起来形态正常的精子进行ICSI操作，故受精的精子不能代表精子样本总体形态情况，也可能是ICSI受精率与精子正常形态率不是一个规律性的变化。

与精子形态对IVF没有预测作用的报道比较发现，第一个原因，可能跟IVF和ICSI的比例不同有关，有些国家使用ICSI不到总周期的30%，有些超过50%甚至高达到90%以上，如美国2013年ICSI比例是67%[15]，英国是52.6%[16]。ICSI比例的加大，IVF受精率受精子形态影响就弱化了。本文ICSI和RICSI的总比例是23.6%，不到30%。第二个原因，可能精子形态分组不一样，王晟等[7]把精子正常形态率分为5%～10%、10%～15%和≥15% 3组，甚至没有≤5%的数据，故得出的结论是当正常形态精子百分率＞5%时，精子形态对常规IVF的治疗结局没有影响。本文按照WHO第五版的标准和趋势，把精子形态分组细化，分节点为1%、4%，在极低的精子正常形态率中，对IVF受精的影响就凸显出来了。

胚胎质量上无论IVF组还是ICSI组，优质胚胎率趋势与精子正常形态率不相同，说明精子形态可能不影响胚胎质量。但是即使本研究显示精子形态对IVF受精率有影响，但是在A组（＜1%）中受精率是67.0%，仍然较卫生部规定的65%高[17]。故建议，精子形态在指导授精方式选择的时候，还要结合精液常规的其他参数，如DNA完整性，以及精子染色质凝聚性、精子凋亡等等。

另外，高洋等[2]提出虽然精子形态可以预测IVF受精率，但受实验条件、技术人员主观差异的影响，各生殖中心应建立自己的正常形态cut-off值作为常规IVF选择。与WHO第五版比较，本中心精子正常形态率的百分位数分布显示，整体精子正常形态率低很多，WHO第五版第50个百分位是15.0%，我们是3.86%，这都提示在精子正常形态的诊断中技术人员主观性可能起了非常大的影响。印度为了降低技术人员的主观差异专门组织174名实验工作人员进行精子形态培训[18]，这是非常必要的。此外，精子形态检查还具有多态性，Nikolettos等[19]指出用光学显微镜行精子检查只能提供有限的信息，精子的超微结构更能说明形态对精子的影响。因此，胞质内形态学选择精子注射（IMSI）和活动精子细胞器形态学检查（MSOME）技术的应运而生，希望能改善ICSI的临床结局。

总之，精子形态一定程度上预示着精子的功能，影响辅助生殖治疗中IVF的受精结局。但在选择IVF还是ICSI的授精方式时，最好结合其他精液常规，如精子浓度、活力和DNA完整率等，防止IVF完全不受精或ICSI的过度使用。

参考文献

1 世界卫生组织.谷翊群译.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册.北京:人民卫生出版社,2011:45-86,192

2 高洋,刘东云,张孝东,等.原发不育精子形态对常规体外受精(IVF)结局的影响.重庆医科大学学报 2010;35(9):1427-1429

3 张科,朱文兵,范立青,等.精子形态正常率与体外受精妊娠结局的关系.中南大学学报•医学版 2010;35(7):738-742

4 王贺,周亮,石敏,等.不育男性精子形态与体外受精妊娠结局的相关性研究.中国男科学杂志 2012;26(1):23-26

5 陈静华,张宁锋,王文军,等.精子正常形态百分率与体外受精胚胎移植临床结局的相关性分析.中国男科学杂志 2011;25(12):34-37,41

6 乜照燕,张娜,吴海峰,等.精子畸形程度对常规体外受精-胚胎移植治疗的影响.中华泌尿外科杂志 2010;31(6):424-427

7 王晟,郐艳荣,贺占举,等.精子形态对体外受精-胚胎移植治疗结局的影响.中国性科学 2013;22 (3):3-6,12

8 Ombelet W,Menkveld R,Kruger TF,et al.Sperm morphology assessment:historical review in relation to fertility.Hum Reprod Updat 1995;1(6):543-557

9 张欢,潘承双,吴永根,等.供精液参数对供精常规体外受精临床结果的影响.生殖医学杂志 2012;21(6):573-577

10 Menkveld R,Holleboom CA,Rhemrev JP.Measurement and signifi cance of sperm morphology.Asian J Androl 2011;13(1):59-68

11 Li B,Ma Y,Huang,Huang J,et al.Probing the effect of human normal sperm morphology rate on cycle outcomes and assisted reproductive methods selection.PLoS One 2014;9(11):e113392

12 Ghirelli-Filho M1,Mizrahi FE,Pompeo AC,et al.Infl uence of strict sperm morphology on the results of classic in vitro fertilization.Int Braz J Urol 2012;38(4):519-528

13 Van den Hoven L,Hendriks JC,Verbeet JG,et al.Status of sperm morphology assessment:an evaluation of methodology and clinical value.Fertil Steril 2015;103(1):53-58

14 Gandini L,Lombardo F,Paoli D,et al.study of apoptotic DNA fragmentationg in human spermatozoa.Hum Reprod 2001;15(4):830-839

15 The Society for Assisted Reproductive Technology.Clinic Summary Report[EB/OL].https://www.sartcorsonline.com/.2015

16 Human Fertilization Embryology Authority.Fertility treatment in 2013:trends and fi gures[EB/OL].http:// www.hfea.gov.uk/.2015

17 中华人民共和国卫生部.人类辅助生殖技术规范.卫科教发[2003]176号文件,2003.6.27

18 Franken DR,Joshi C.Sperm morphology training in India.Andrologia 2015;47(8):932-934

19 Nikolettos N,Küpker W,Demirel C,et al.Fertilization potential of spermatozoa with abnormal morphology.Hum Reprod 1999;14 Suppl 1:47-70

（2015-06-15收稿）

·临床经验·

Effects of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes

Ji Kaili,Guo Jianghua,Liang Huihong,Guan Yiqing,Lou Juan
Center for Assisted Reproduction,Jiangmen Central Hospital,Jiangmen 529030,Guangdong,China

AbstractObjectivee To investigate the infl uence of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes of in vitro fertilization (IVF),and explore its prediction value in choosing treatment methods on assisted reproductive technology(ART).Metthhooddss This study retrospectively analyzed 1951 cycles of infertile couples treated with conventional IVF,ICSI or rescue ICSI(RICSI) from June 2012 to February 2015,and according to 4% as the lower reference limits of sperm normal morphology provided by WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th Edition),the cycles were divided into three groups:470 cycles with values<1.0% in A group;562 cycles with values ≥1.0% and <4% in B group;and 919 cycles with values ≥4.0% in C group.Ressuullttss There were extremely signifi cant differences in sperm concentration,total motility,progressive motility and DNA integrity among three groups (P<0.01),but no signifi cant difference in acrosin activity.There were positive correlations between sperm normal morphology and other parameters.Meanwhile,the percentage of IVF was 72.3%,86.7% and 96.8%,and the percentage of ICSI was 27.7%,13.3% and 3.2%,respectively,there were statistically signifi cant differences in treatment methods (P<0.01).the percentage of RICSI decreased by sperm normal morphology.Fertilization rate (67.0%,70.0% and 79.6%) had extremely signifi cant difference only in conventional IVF group(P<0.01),and with the increase in sperm normal morphology,fertilization rate increased;there was no consistent trend in embryo quality among different insemination ways.Concluussiioonn There is positive correlation between sperm normal morphology and most semen parameters,and sperm morphology infl uences IVF fertilization rate,which is some valuable indicatior to select IVF or ICSI on ART treatment.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.09

中图分类号R 321-33