助剂强化碱预处理对玉米秸秆酶解糖化的影响

迟聪聪， 柳　咪， 来　贤， 陈思拓

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术与特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安　710021； 2.齐鲁工业大学 制浆造纸科学与技术教育部重点实验室， 山东 济南　250353； 3.北京印钞有限公司， 北京　100054)



助剂强化碱预处理对玉米秸秆酶解糖化的影响

迟聪聪1,2， 柳咪1， 来贤1， 陈思拓3

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术与特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安710021； 2.齐鲁工业大学 制浆造纸科学与技术教育部重点实验室， 山东 济南250353； 3.北京印钞有限公司， 北京100054)

摘要：在前期研究的基础上，探讨了不同助剂强化碱预处理对玉米秸秆酶解糖化效果的影响.研究结果表明，玉米秸秆经过氧化氢(H2O2)或吐温(Tween)-80强化碱预处理后，其提取液的固形物含量均随助剂用量的增加而增加，木糖得率也基本呈上升趋势，且预处理后底物的酶水解糖得率(对原料总糖)也有不同程度的上升.在一定条件下，助剂用量或碱浓越高，预处理及酶水解转化过程的总糖得率越高，对应原料失重也越高.综合考虑助剂用量、成本及效果等因素，吐温-80强化碱预处理效果相对较好.

关键词：玉米秸秆; 碱预处理; 酶解糖化; 过氧化氢; 吐温-80

0引言

农作物秸秆作为世界上仅次于煤、石油、天然气的第四大能源，其合理利用直接关系到农业和社会经济的可持续发展.近些年来，随着能源供给矛盾的日益突出以及传统石化燃料对环境污染的加剧，寻找并开发一种可再生的清洁替代能源已是势在必行.燃料乙醇以其环境友好、原料可再生及可持续利用等特性，正越来越受到该领域研究者的广泛关注[1-4].其中，利用木质纤维资源(主要是农林废弃物秸秆)制取燃料乙醇，已成为世界各国的研究热点[5].

秸秆向燃料乙醇转化主要包括以下步骤：原料预处理、酶解、戊糖己糖发酵及分离纯化等[6,7].但由于原料中纤维素、半纤维素和木质素以致密的超分子复合体结构存在，使得纤维素及半纤维素直接酶水解较困难.天然秸秆原料(未经预处理直接进行酶解)的纤维素酶水解糖得率一般低于20%.因此，要提高木质纤维素的酶解效率，在酶解前必须先破坏木素保护层并改变纤维素的结晶结构[8,9].

而常见的预处理方法有物理法、化学法和生物法等，其方法和强度直接影响后续酶解和发酵过程.目前，对秸秆常用的预处理方法是化学法，如氨化(尿素、无水氨、碳酸氢氨、硫酸铵等)、碱化(氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾)等[10-12].秦伟军等[13]的研究结果表明，碱预处理玉米芯可除去部分木质素及半纤维素，保留纤维素.木素去除越多，纤维素酶越易与底物接触，酶解效率越高.但在去除大量木素的同时，有相当一部分半纤维素也被碱液溶解，造成碳源损失;赵志刚[14]研究发现，H2O2预处理只能溶解少量木素，而纤维素和半纤维素得率均较高.但当NaOH与H2O2两者配合使用时，溶解木素的能力可以得到很大提升，半纤维素得率比单独使用NaOH时略高，但低于单独用H2O2时的得率，纤维素损失也很少.这可能因为混合溶液中的部分NaOH被H2O2中和，减弱了其对半纤维素的降解溶出能力；黄涛等[15]利用吐温-80强化碱预处理稻草秸秆，发现添加0.1%吐温-80，可进一步降低底物中木质素及灰分含量，提高纤维素得率，增强酶解糖化效果.

本研究探讨了H2O2及吐温-80强化碱预处理对玉米秸秆预处理提取液中固形物含量与木糖得率、酶解糖得率及原料失重等的影响.其研究结果对于木质纤维素转化燃料乙醇具有一定的借鉴意义.

1实验部分

1.1实验原料

玉米秸秆取自西安市马王镇.风干后去除外层叶片、切段、磨粉、筛选，取未通过40目网筛的玉米秸秆粉作为研究对象.

1.2仪器及试剂

(1)主要仪器：FZ102型植物粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；THZ-82型数显水浴恒温振荡器，常州博远实验分析仪器厂；飞鸽牌系列KA-1000型离心机，上海安亭科学仪器厂；UV752型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-3C型 PH计，上海仪电科学仪器股份有限公司.

(2)主要试剂：研究所用氢氧化钠、过氧化氢、吐温-80、硫酸、乙酸、乙酸钠、盐酸、间苯三酚及葡萄糖等均为分析纯试剂，实验所用木糖、纤维素酶Cellic CTec2均为生化试剂.前者购自上海伯奥生物科技有限公司，后者由诺维信公司提供，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法[16]测其酶活为185 FPU/mL.

1.3实验方法

1.3.1碱预处理

预处理在恒温振荡水浴锅中进行.反应条件为:绝干玉米秸秆粉5 g，振荡转速140 rpm，固液比1∶10(g∶mL)，氢氧化钠浓度为2%、10%，过氧化氢用量为0%、1%、2%、3%(或吐温-80用量为0%、0.1%、0.2%、0.3%)，温度70 ℃，预处理反应时间3 h(或6 h).

反应结束后，利用G3砂芯坩埚通过真空过滤进行固液分离，玉米秸秆粉用去离子水充分洗涤至中性，风干备酶水解用，预处理提取液用于分析还原糖得率及固形物含量(重量法[17]).

1.3.2酶解糖化

将章节1.3.1所得风干底物在恒温振荡水浴锅中进行酶水解.酶解条件为:温度50 ℃，转速180 rpm，反应时间48 h，底物浓度5%，酶用量10 FPU/g绝干底物，乙酸/乙酸钠缓冲溶液pH为4.8.

酶解完成后，用G3玻璃滤器进行固液分离，然后对酶解液中的生物酶进行灭活处理(置于沸水浴中5 min后，在3 500 rpm转速下离心分离5 min)，取上清液待还原糖分析用；酶解残渣充分洗涤后，经电热鼓风干燥箱烘干，计算预处理及酶解过程玉米秸秆粉失重，其具体计算方法如式(1)：

(1)

1.3.3还原糖分析

利用紫外-可见分光光度计分析酶解液及预处理提取液中的五碳糖(主要是木糖)及六碳糖(主要为葡萄糖)，具体方法见参考文献[18].提取液的还原糖得率y1及酶解还原糖得率y2的计算方法如式(2)～(3)：

(2)

(3)

1.3.4原料中还原糖分析

将经苯醇抽提后的玉米秸秆粉试样进行两步酸水解.先用72% H2SO4在常温下处理2.5 h，然后用去离子水稀释至3% H2SO4，连续煮沸4 h(期间适时补充去离子水)[17].反应结束后，固液分离，按照章节1.3.3分析滤液中五碳糖与六碳糖，两者之和即为原料中总还原糖含量.

2结果与讨论

2.1助剂对碱预处理提取液的影响

2.1.1H2O2

玉米秸秆粉在不同条件下经H2O2强化碱预处理后，其提取液中溶出大量半纤维素及降解产物、木质素与抽出物等，这些溶出物直接影响提取液中的固形物含量.一般来说，草类原料中的半纤维素种类主要是聚木糖，试样经进一步水解，其主要产物为木糖[17].

图1为玉米秸秆粉在不同条件下进行H2O2强化碱预处理的结果.由图1可知，预处理提取液的固含量及木糖得率均随过氧化氢用量的增加呈现递增趋势.这是因为在碱性条件下，H2O2可以更有效地氧化降解木质素，并且半纤维素也会发生一定程度的水解并溶出小分子碎片.已有文献报道，H2O2在碱性环境中会电离产生过氧根离子.虽然过氧根离子的氧化能力远不如H2O2，但它对亲电中心具有更高的反应活性，可以更有效地氧化降解木质素.确切地说，H2O2只会与木质素降解产生的酚类化合物发生作用使其降解，而对纤维素几乎无影响[14].

在预处理过程中，NaOH也会使纤维素产生明显润胀，降低纤维素结晶度，且通过脱除木质素及降解半纤维素来提高酶解的有效接触面积，从而提高酶的可及度[19].提取液的糖类组分分析结果表明，其主要成分为木糖，几乎不含葡萄糖，这是因为碱可以有效脱除玉米秸秆结构中的乙酰基，从而有利于半纤维素的降解.由图1(b)可以看出，在本研究的H2O2用量范围内，当其用量为3%时，木糖得率最高为26.05%.

进一步分析图1中的曲线还可以得知，当碱浓为2%时，预处理时间6 h与3 h相比，其提取液中固含量及木糖得率均较高，并且增长幅度随H2O2用量的增加越来越明显.这一现象表明，在70 ℃下预处理3 h，H2O2并未分解完全，继续延长时间可进一步强化碱预处理促进木素等降解溶出.当反应时间为6 h时，碱浓10%的固含量及木糖得率要远远大于碱浓2%，这一现象说明碱浓的影响较显著.

(a)提取液固含量

(b)提取液中总还原糖木糖得率=预处理提取液中木糖/原料中总糖；固含量=预处理提取液中固形物/原料绝干重.下同.图1　H2O2强化碱预处理对提取液的影响

2.1.2吐温-80

作为非离子表面活性剂，吐温-80可用于酶水解过程，通过降低木质素对纤维素酶的无效吸附，从而增加纤维素酶与底物的接触，进而达到提高酶解效率的目的.本研究将吐温-80作为助剂应用到碱预处理过程，主要是因为它能够增强玉米秸秆粉的润湿性，使碱液更容易渗透其中，从而进一步促进了木质素的降解[20].吐温-80强化碱预处理促进酶解糖化的结果见图2所示.

由图2可知，提取液固含量与木糖得率随吐温用量的变化趋势与图1中加入过氧化氢相类似，但当碱浓为2%时，反应时间由3 h延长至6 h，其固含量与木糖得率无显著、规律性差异.图2(a)表明，在一定范围内，当碱浓、温度及预处理时间一定时，预处理提取液中的固含量(不包含碱)随吐温用量的增加而增加，这是因为非离子表面活性剂吐温-80同时具有亲水和疏水特性，预处理过程能够有效降低溶液的表面张力，润湿玉米秸秆表面，使得碱液更容易渗透，且表面活性剂还可以有效地从木质素表面分离疏水性降解产物，对木质素降解产生增溶作用[21,22]，从而达到提高木聚糖反应活性的目的；由图2(b)可以得出，当吐温用量为0.3%时，预处理提取液中的木糖得率最高为25.98%.与过氧化氢类似，当反应时间为6 h时，碱浓2%的木糖得率要远远低于碱浓10%.

(a)提取液固含量

(b)提取液中总还原糖图2　吐温-80强化碱预处理对提取液的影响

2.2助剂用量对还原糖得率的影响

2.2.1H2O2

图3与图4分别显示H2O2用量对原料失重及还原糖得率的影响.通过比较图3与图4(b)得知，两者变化趋势大体一致.由图3可知，原料失重随H2O2用量的增加而增加，最高达99.44%.碱浓的影响较显著，在其它条件相同时，碱浓10%较2%其失重增加了6个百分点左右.从图3还可发现，当碱浓2%时，总体呈现预处理时间6 h较3 h的原料失重高，但H2O2用量为3%时除外.这一方面可能与实验误差有关，另一方面可能由于反应时间的延长导致降解溶出物重新沉积到固形物表面，后者有待进一步研究验证.

图4(a)结果表明，在一定条件下，酶解总糖得率随H2O2用量的增加而增加，这是因为预处理过程中较高的过氧化氢用量更有利于木质素的脱除及半纤维素的降解，使酶解底物的总表面积增加，从而更有利于纤维素酶可及度的提高；由图4(b)可知，预处理及酶水解过程所得总糖得率之和也随H2O2用量的增加而增加，最高得率达80.64%.此外，当碱浓10%时，过氧化氢用量较低(1%～2%)或H2O2/NaOH比较低时对总糖得率的影响相对不显著，但当H2O2用量增至3%时，总糖得率有明显提高.这表明在过氧化氢强化碱预处理过程中，需要适当提高H2O2与NaOH的比例，这与碱性过氧化氢漂白相类似.

图3　H2O2用量对原料失重的影响

(a)酶解总糖

(b)预处理提取液及酶解液总糖图4　H2O2用量对总糖得率的影响

2.2.2吐温-80

吐温-80用量对原料失重及提取液与酶解液中总还原糖得率的影响分别如图5、图6所示.对比分析图5与图6(b)得知，与章节2.2.1所述类似，两者变化趋势基本一致.图5中的曲线显示，吐温用量对原料失重具有较显著影响，原料失重随吐温-80用量的增加而增加，最高可达98.91%.同时，碱浓的影响也较显著，碱浓10%较2%其失重增加了6个百分点左右.

由图6可知，与章节2.2.1所述H2O2的强化效果类似，酶解总糖得率随吐温-80用量的增加基本呈上升趋势；预处理及酶水解过程总糖得率之和随着吐温用量的增加呈上升趋势，其值可高达80.89%.图6(b)显示，当碱浓为10%时，添加吐温用量(0.1%～0.2%)较低时对总糖得率无显著影响；而碱浓为2%时，总糖得率随吐温用量的增加明显提高.这说明在吐温-80强化碱预处理过程中，适当降低NaOH与吐温-80的比例有利于总糖得率的提高.此外，当碱浓为2%时，反应时间3 h与6 h条件下所对应的预处理及酶水解总糖得率之和较为接近.

图5　吐温-80用量对原料失重的影响

(a)酶解总糖

(b)预处理提取液及酶解液总糖图6　吐温-80用量对总糖得率的影响

2.3两种助剂效果的比较

为比较两种不同助剂强化碱预处理的效果及其对酶水解的影响，在一定预处理条件下(碱浓10%、液比1∶10、温度70 ℃、时间6 h)以不添加任何助剂作为对照，与相同条件下添加过氧化氢(用量3%)或吐温-80(用量0.3%)的结果进行对比，其结果如表1所示.

由表1数据可知，添加助剂过氧化氢或吐温-80后，预处理提取液与酶解液总糖得率之和提高了4个百分点左右(由76.65%提高至80.64%/80.89%)，其中预处理总糖得率提高了1个百分点，而酶解总糖得率提高了3个百分点.

比较两种不同助剂的实验结果，可发现H2O2用量3%与吐温-80用量0.3%强化碱预处理并酶水解后的总糖得率相近，两者均为80%左右.其中，后者比前者仅高出0.25个百分点.综合总糖得率及两种助剂的用量与成本(按实验室所购买试剂价格折算：H2O2约40元/kg，吐温-80约36元/kg)进行分析，可得出：吐温-80强化碱预处理效果相对较好.

表1　总糖得率对比分析

注：其它相同条件为温度70 ℃、时间6 h、碱浓10%、液比1∶10

3结论

(1)玉米秸秆粉经H2O2强化碱预处理过程中，当碱浓、温度及反应时间一定时，预处理提取液的固含量及木糖得率均随H2O2用量(0%～3%)的增加而增加，木糖得率最高达26.05%.在一定范围内，相对较高碱浓有助于固含量及木糖得率的提高.同时，预处理底物的酶解糖得率也随H2O2用量(0%～3%)的增加而增加，其最高可达65.60%(对原料总糖).

(2)吐温-80强化碱预处理玉米秸秆粉时，在一定范围内，其提取液固含量及木糖得率均随吐温用量(0%～0.3%)的增加而增加.当预处理条件为碱浓10%、液比1∶10、吐温-80用量0.3%、温度70 ℃、反应时间6 h时，木糖得率最高达25.98%，此时提取液固含量最高为49.30%，酶解糖得率最高为64.38%(对原料总糖)，较未添加吐温时提高了10个百分点左右.

(3)在一定范围内，H2O2或吐温-80用量越高，总糖得率越高，其对应失重也越高，最高总糖得率均在80%左右，较未添加任何助剂时提高了4个百分点左右.此外，碱浓对总糖得率的影响也较显著.综合不同助剂的用量、成本及酶解效果，吐温-80强化碱预处理效果相对较好.

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【责任编辑：晏如松】

Effects of alkaline pretreatment enhanced by additives on the enzymatic saccharification of corn straw

CHI Cong-cong1,2， LIU Mi1， LAI Xian1， CHEN Si-tuo3

(1.College of Light Industry Science and Engineering, Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Key Laboratory of Pulp and Paper Science & Technology of Ministry of Education, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China; 3.Beijing Banknote Printing Co., Ltd., Beijing 100054, China)

Abstract:The effects of alkaline pretreatment enhanced by additives on the enzymatic saccharification of corn straw were analyzed based on previous study.Results show that the solid content in the extract is higher for higher additive dosage,while the variation trend of xylose yield is increased for the alkaline pretreatment enhanced by two additives,H2O2 or Tween-80.The sugars yield (based on the total carbohydrates in raw materials) of pretreated substrate shows different degree of rise after enzymatic hydrolysis.Under certain conditions,the total reducing sugar yield and weight loss are higher for higher additive dosage or alkali concentration.Finally considering all factors,including the additive dosage,the cost, the efficiency of enzyme hydrolysis and so on,the pretreatment of NaOH+Tween-80 exhibits a relatively better effect.

Key words:corn straw; alkaline pretreatment; enzymatic saccharification; H2O2; Tween-80

中图分类号：TQ353

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)03-0022-06

作者简介:迟聪聪(1981-)，女，山东青岛人，讲师，博士，研究方向：木质纤维资源综合利用及功能材料转化

基金项目：陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年人才项目(2015JQ3077)； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20126125120002)； 齐鲁工业大学制浆造纸科学与技术教育部重点实验室开放基金项目(KF201401)； 陕西科技大学博士科研启动基金项目(BJ11-18)

收稿日期:2016-02-03