酶预处理结合高压均质机制备纤维素微纤丝的初步研究

王志杰， 康　艳， 王　转， 李新平， 陈立红

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安　710021； 2.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安　710021)



酶预处理结合高压均质机制备纤维素微纤丝的初步研究

王志杰1， 康艳1， 王转1， 李新平1， 陈立红2

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室， 陕西 西安710021； 2.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安710021)

摘要：采用三种纤维素酶(复合纤维素酶、外切纤维素酶、内切纤维素酶)分别预处理漂白马尾松纤维，处理后的纤维通过高压均质机来制备纤维素微纤丝(CMF).对CMF的形态、直径、晶型结构、结晶度、热性能等进行了研究.结果表明，制备出的CMF悬浮液呈半透明的凝胶状，具有良好的稳定性，阳离子需求量大约为对照样的10倍；CMF直径分布在20～60 nm间；CMF薄膜具有良好的透光性；CMF中纤维素的分子结构和晶型结构都未发生变化，与天然纤维素基本相同；CMF的热稳定性没有发生明显的变化.

关键词：酶预处理； 纤维素微纤丝； 高压均质机

0引言

纤维素微纤丝(cellulose microfibril，简称CMF)，是一种在高速高压剪切与冲击力作用下将植物纤维剥离成直径小于100 nm，长度为几百个纳米甚至达到微米级别的微细纤维，是一种新型的纳米纤维素材料.由于其具有许多优异的性能，被广泛应用于食品、医药、包装、造纸和复合材料等领域，市场前景十分广阔[1].

CMF的制备可分为机械法和预处理结合机械法.机械解离制备CMF，即不对纤维做任何化学处理，主要借助摩擦力和剪切力使纤维解离成微纤丝.1983年，Herrick等[2]和Turbak等[3]以亚硫酸盐铁杉浆为原料，通过高压均质化制备出了CMF.但机械法制备CMF最突出的缺点就是能耗极高，为20～40 kWh/kg[4].所以，一般在机械处理前对纤维进行预处理来减小纤维尺寸，降低解离能耗.常用的预处理方法有酸碱预处理、有机溶剂预处理、氧化剂预处理和酶预处理.酸、碱和有机溶剂处理会产生大量的杂质，而且要分离得到纯的CMF需消耗大量的水资源及动力资源，不利于环保[1].TEMPO氧化预处理容易引起纤维素的剥皮反应，导致纤维素的降解不均匀和过度降解等问题[1].而采用生物酶预处理相对来说更加环保.Henriksson和Pääkkö等采用内切葡聚糖酶预处理，酶预处理后的纤维结构更加疏松，成功制备出CMF，且发现用酶预处理得到的CMF比用酸预处理得到的CMF具有更有利的结构[5,6].有研究发现，酶预处理制得的纳米纤维素比其他化学预处理方法制得的纳米纤维素在物理强度方面效果更好[7-9].

本文采用三种纤维素酶(复合纤维素酶、外切纤维素酶、内切纤维素酶)对漂白马尾松纤维进行预处理，处理后的纤维通过高压均质机制备CMF，并对CMF的形态、直径、结晶结构、热性能等进行了初步研究.

1实验部分

1.1原料

浆料：漂白马尾松纤维(未干燥过的纸浆)，取自国内某造纸企业；复合纤维素酶(Celluclast 1.5 L，购自sigma公司)：滤纸酶活90.67 FPU/mL；内切纤维素酶(LPK-RZ011-SX，购自绿维康生物工程有限公司)：CMC酶活2.65 CMCU/mL；外切纤维素酶(LPK-RZ012-SX，购自绿维康生物工程有限公司)：滤纸酶活0.965 FPU/mL；柠檬酸(C6H8O7·H2O)，固体NaOH，3,5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)，苯酚(C6H5OH)，无水亚硫酸钠(Na2SO3)，试剂均为分析纯.

1.2主要仪器

高压均质机(型号：HP-4L，喜高精密流体机械有限公司)；扫描电子显微镜(型号：S4800，日本日立公司)；胶体电荷测定仪(型号：PCD-03，德国Mütek公司)；傅里叶变换红外光谱仪(型号：VECTOR-22，德国Bruker公司)；X射线衍射仪(型号：D/max 2200DC，日本理学株式会社)；同步热分析仪(型号：STA449 F3，德国耐驰).

1.3实验方法

1.3.1酶预处理

将称好的浆料置于锥形瓶中，加入一定量经稀释的酶液和pH为4.8的柠檬酸纳缓冲液，调节浆浓为3%，然后置于恒温水浴振荡器中，设定温度为50 ℃，反应2 h.反应结束后立即用沸水浴灭活10 min，用蒸馏水反复洗涤，布氏漏斗抽滤，收集酶预处理后的纤维，平衡水分，备用.三种纤维素酶预处理，纤维得率为80%时，复合纤维素酶、内切纤维素酶和外切纤维素酶的酶用量分别为10 FPU/g、50 CMCU/g和8 FPU/g.

1.3.2CMF的制备

称取少量酶预处理过的纤维(纤维得率80%)，稀释至1.5%的浓度.只有内切纤维素酶预处理过的纤维能通过均质机，所以，对复合纤维素酶和外切纤维素酶预处理过的纤维用美的搅拌机在18 000 r/min的转速下搅拌60 s，使纤维长度减小以缓减均质机的堵塞，搅拌结束后，用高压均质机对纤维悬浮液进行均质处理，循环次数30次，压力<150 MPa.

1.3.3CMF薄膜的制备

取一定量的CMF悬浮液，将微孔纤维素滤膜置于砂芯漏斗中，抽滤，得到湿的CMF薄膜.上下各放置一张微孔纤维素滤膜和2张滤纸，在200 kPa压力下挤压3 min，更换滤纸，将CMF薄膜及滤纸一同夹于表面平滑的玻璃板之间，在真空干燥箱中干燥24 h，干燥条件：60 ℃，-760 mmHg.

1.4分析检测

1.4.1形态及悬浮液稳定性分析

将对照样(未经处理的漂白马尾松纤维)、酶预处理后纤维及CMF悬浮液静置一定时间，观察沉降程度.

将制备好的CMF稀释100倍，取少量经冷冻干燥机干燥后，用日立S4800扫描电镜进行拍照观察，电压3.0 kV.

1.4.2阳离子需求量的测定

采用胶体滴定法测定对照样及CMF悬浮液的阳离子需求量.取10 mL稀释至0.01%浓度的对照样或CMF悬浮液，用阳离子标准液进行反滴，用胶体电荷测定仪测定其阳离子需求量的大小，计算公式见式(1)，重复3次取平均值.

q=V·c/Wt

(1)

式(1)中：q—阳离子需求量(μmol/g)；V—消耗的标准液的体积(mL)；c—标准液的电荷密度(mol/L)，本实验中为0.001 mol/L；Wt—被测样品的质量(g).

1.4.3CMF薄膜光学性能分析

将制备好的CMF薄膜平铺在彩色纸板上，观察其透光性，并用相机拍照.

1.4.4红外光谱分析

称取3.5～4.0 mg经冷冻干燥后的对照样及CMF和350 mg过200目筛的光谱纯KBr，在玛瑙钵中研磨混合.将300 mg混合均匀的样品在真空干燥箱中干燥，干燥条件为：60 ℃，-760 mmHg，4 h.干燥结束后直接将样品倒入红外压片模中，在10 MPa压力下压3 min，将得到的透明片基用于FTIR分析测试.检测条件：波数分辨率1 cm-1，波数500～4 000 cm-1.

1.4.5X-射线衍射分析

取少量冷冻干燥后的对照样及CMF样品，倒入红外压片模中，在10 MPa压力下压5 min，用制成的片剂在D/max2200PC X-射线衍射仪上作结晶衍射图.检测条件：Cu靶Ka射线，管压40 kV，管流40 mA，扫描速度4 °/min.

1.4.6热重分析

将对照样及CMF样品风干后，取少量置于铂坩埚中，用同步热分析仪进行测定，选择氮气氛围，温度范围35 ℃～500 ℃，升温速度为10 ℃/min.

2结果与讨论

2.1悬浮液外观形貌及沉降稳定性观察

将水解得率为80%的3种酶预处理后纤维直接配置成1.5%的纤维悬浮液，未经过任何处理的漂白马尾松纤维作为对照样，各纤维悬浮液的外观形貌如图1所示.

由图1可知，未经过任何处理的漂白马尾松纤维悬浮液静置72 h后，产生了一定的沉降(a).经3种纤维素酶预处理和搅拌后的纤维均沉积在量筒底部，其沉降程度比对照样的大，产生明显的分层(b，c，d).因为对照样纤维较长，表面含有细小纤维，纤维之间容易缠绕在一起.而纤维经3种纤维素酶预处理后，长度都有所减小，加上机械处理，搅拌机刀头较锋利，转速较大，刀头高速旋转对纤维产生的剪切力较大，对纤维有一定的切断作用，使纤维的长度进一步减小.纤维长度减小后，纤维卷曲率和扭结纤维含量均减小，纤维间不易形成缠绕.所以，经酶预处理和机械处理后的纤维悬浮液沉降增强.

对纤维进行酶预处理和机械搅拌后，均质化30次，纤维已经解离出CMF，在水中均匀分散，形成了均一的凝胶状悬浮液，稳定性良好，未产生明显的固液两相分层现象(e，f，g).这是因为纤维被解离成CMF后，比表面积较大，与水的接触面积增加，CMF表面含有丰富的游离羟基，亲水性较强，与水分子产生氢键作用能稳定的分散在水中，形成均匀的悬浮液，外观呈凝胶状.这与Chen等[10]采用化学预处理后再用超声波处理制备出的CMF具有相似的性质，均表现出一定的胶体性质.

a：对照样；b、c、d：分别为复合、内切、外切纤维素酶处理+(搅拌60s)；e、f、g：分别为复合、内切、外切纤维素酶处理+(搅拌60s)+均质化30次，浓度均为1.5%图1　不同纤维素酶预处理后的纤维及CMF悬浮液的外观形貌(静置72 h)

2.2CMF的阳离子需求量

胶体滴定法是用反电荷的标准液去滴定，测得的是浆料中溶解电荷的总量[11,12].表1是纤维解离成CMF后的阳离子需求量，对照样为未经纤维素酶预处理和均质化的漂白马尾松纤维.

由表1可知，纤维在解离成CMF后，阳离子需求量迅速增加，约为对照样纤维的10倍，经不同纤维素酶预处理后得到的CMF，其阳离子需求量差别不大.因为纤维被解离成具有纳米尺寸的CMF后，比表面积增大，微纤丝之间的氢键断裂，表面所含的游离羟基大量的暴露出来.所以，CMF的阳离子需求量明显高于未解离的漂白马尾松纤维.

表1　CMF的阳离子需求量

注：A-复合纤维素酶处理；B-内切纤素酶处理；C-外切纤维素酶处理.

2.3CMF微观形貌观察

采用不同纤维素酶预处理得到CMF的SEM图如图2所示.由图2可以看出，CMF表面光滑，三种纤维素酶预处理制备的CMF直径差异不大，基本分布在20～60 nm间，长度在图片视野中至少达几个微米.由于其直径较小，长度较长，在扫描电镜下较难确定其长度分布.因为纤维已经被解离成具有纳米尺寸的CMF，微纤丝从纤维中分离出来后，微纤丝之间的氢键断裂，在干燥过程中，微纤丝表面暴露出的羟基互相吸引，使微纤丝和微纤丝之间重新连接成网状结构.

(a)复合纤维素酶处理

(c)外切纤维素酶处理图2　不同纤维素酶预处理制备的CMF的SEM图(×50 000)

2.4CMF薄膜光学性能分析

漂白马尾松纤维经过不同的纤维素酶处理和机械搅拌，均质化30次制备出的CMF薄膜如图3所示.由图3可知，CMF薄膜呈半透明状，具有较好的透光性，且表面平整，没有明显的褶皱.纳米纤维素的直径小于可见光波长的十分之一时光的散射非常小，因此，纳米纤维素的透光度较高[13].CMF的尺寸与薄膜的透光性密切相关，有研究发现增加机械处理程度会使制备的纳米纤维素膜的不透明度下降[13,14].

(a)复合纤维素酶处理(b)内切纤维素酶处理(c)外切纤维素酶处理图3　CMF薄膜的透光性能

2.5红外光谱分析

采用3种酶预处理纤维，制备的CMF的红外光谱分析结果如图4所示.由图4可知，CMF和对照样纤维的红外光谱图曲线趋势大致相同，出峰位置基本一致，化学官能团未发生明显的改变.这说明纤维经酶预处理后，再对其进行均质化的机械处理过程中没有新的官能团产生，CMF仍然保持天然纤维素的分子结构，并未发生变化.

a:对照样；b、c、d:分别为复合、内切、外切纤维素酶预处理得到的CMF图4　CMF的FTIR图

2.6XRD分析

分别采用3种纤维素酶对漂白马尾松纤维进行预处理，制备的CMF的X-射线衍射分析结果如图5所示.由图5可知，CMF的衍射峰的强度虽有改变，但衍射角都在16.0 °和22.5 °附近出现特征吸收峰，仍属于纤维素I的晶态结构，这说明CMF仍然保持纤维素I的晶型结构，纤维经过纤维素酶预处理后，均质化只是将纤维解离成CMF，并不会引起纤维素晶型结构的改变.

a:对照样；b、c、d:分别为复合、内切、外切纤维素酶预处理得到的CMF图5　CMF的XRD图

2.7CMF的结晶度分析

分别采用3种纤维素酶对漂白马尾松纤维进行预处理，制备的CMF的结晶度变化情况见表2所示.按照公式(2)计算CMF的结晶度[15].

(2)

式(2)中：I002—(002)衍射角的极大强度，代表结晶区的衍射强度；Iam—2θ=18 °时的衍射强度，即非结晶背景的衍射强度.

由表2可见，CMF的结晶度要高于漂白马尾松纤维的结晶度，是因为纤维素酶预处理纤维时，由于纤维是一种多孔的天然高分子材料[16]，无定形区分子呈无序排列，结构疏松，酶首先作用于纤维素的无定形区[17]，使无定形区发生降解，导致CMF的结晶度增大[18].

表2　CMF的结晶度

注：A-复合纤维素酶处理；B-内切纤素酶处理；C-外切纤维素酶处理.

2.8热性能分析

图6和图7分别是采用3种纤维素酶预处理结合机械处理，制备的CMF的TGA和DTG图，对照样为未经过任何处理的漂白马尾松纤维.

由图6可知，经纤维素酶预处理和机械处理后，CMF的热重曲线与对照样纤维的热重曲线趋势大致相同，降解温度也没有明显的改变.所以，纤维素酶预处理和机械处理对CMF的热性能没有明显的影响.第一次质量损失为纤维中游离水分的蒸发，发生在温度为35 ℃～180 ℃的范围内，但质量下降幅度较小.第二次质量损失是CMF的热降解，发生在200 ℃～370 ℃，CMF的开始降解温度在220 ℃左右，在300 ℃～370 ℃时，CMF快速降解，在355 ℃左右降解速率达到最大，与天然纤维素的降解温度基本相同.第三次质量损失是CMF的热降解产物，碳的热分解，在370 ℃～500 ℃范围内，有少量的质量损失.最后CMF的残留率在20%左右.

CMF的DTG曲线显示只有一个失重峰，说明CMF的热裂解也是一步完成的.CMF的热裂解速率略低于对照样，这可能是因为CMF的结晶度较高.

a:对照样；b、c、d:分别为复合、内切、外切纤维素酶预处理得到的CMF图6　CMF的TGA曲线

a:对照样；b、c、d:分别为复合、内切、外切纤维素酶预处理得到的CMF图7　CMF的DTG曲线

3结论

(1)用三种纤维素酶(复合纤维素酶、外切纤维素酶、内切纤维素酶)预处理过的漂白马尾松纤维以1.5%的浓度通过高压均质机循环30次，可以制备出CMF.制备出的CMF悬浮液呈半透明的凝胶状，具有良好的稳定性，阳离子需求量约为对照样纤维的10倍.CMF直径分布在20～60 nm 之间，长度较长.CMF薄膜具有良好的透光性.

(2)FTIR和XRD分析结果显示，CMF中纤维素的分子结构和晶型结构都未发生变化，与天然纤维素基本相同.与未经过任何处理的对照样纤维相比，CMF的结晶度增加.

(3)CMF的热稳定性没有发生明显的变化，开始分解温度为220 ℃，最大降解温度仍在355 ℃左右，与天然纤维素的保持相同.

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【责任编辑：蒋亚儒】

A preliminary study on cellulose microfibril preparation by high pressure homogenizer with enzymatic pretreatment

WANG Zhi-jie1， KANG Yan1， WANG Zhuan1， LI Xin-ping1， CHEN Li-hong2

(1.College of Light Industry Science and Engineering, Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021， China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021， China)

Abstract:Bleached masson pine fibers were respectively pretreated by three kinds of cellulase (complex cellulase,exo-cellulase,endo-cellulase) and then cellulose microfibril (CMF) was prepared using high pressure homogenizer. Morphology,diameter,crystal structure, crystallinity and thermal properties etc. of CMF was investigated.The results showed that CMF suspension is translucent,like gel,has good stability, and has about 10 times of cationic demand to the control sample; the diameter distribution of CMF is 20 nm to 60 nm;CMF film has good transparency;molecular structure and crystal structure of cellulose in CMF has not changed,basically the same with natural cellulose;and the thermal stability did not changed significantly.

Key words:enzymatic pretreatment； CMF； high pressure homogenizer

中图分类号：TQ353

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2016)03-0016-06

作者简介:王志杰(1959-)，男，陕西榆林人，教授，硕士，研究方向：纤维科学及造纸技术

基金项目：国家自然科学基金项目(31370578)； 陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目(2014JZ013)

收稿日期:2016-03-20