胰岛素受体亚型改变及相关通路活化在糖尿病小鼠肠上皮细胞过度增殖中的作用*

欧阳慧，　夏忠胜，　杨洪生，　于　涛，　卢锡基，　许稷豪，　陈其奎

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东 广州 510120)



胰岛素受体亚型改变及相关通路活化在糖尿病小鼠肠上皮细胞过度增殖中的作用*

欧阳慧，夏忠胜，杨洪生，于涛△，卢锡基，许稷豪，陈其奎

(中山大学孙逸仙纪念医院消化内科，广东 广州 510120)

[摘要]目的： 探讨胰岛素受体亚型改变及其相关下游通路活化情况在糖尿病小鼠肠上皮细胞异常增殖中的作用。 方法: 用腹腔注射链脲霉素的方法制作糖尿病小鼠模型，采用增殖细胞核抗原标记法比较糖尿病小鼠及对照组小鼠肠上皮细胞的增殖情况。利用RT-PCR法测定胰岛素受体亚型表达比例在2组中的差异。采用real-time PCR及Western blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测2组之间胰岛素受体相关通路各分子MEK1/2、ERK1/2、PI3K以及Akt的表达情况。 结果: 糖尿病组小鼠的小肠上皮细胞增殖指数显著升高(P<0.05)，且细胞中胰岛素受体亚型IR-A/IR-B的比值也明显升高(P<0.05)。糖尿病小鼠肠上皮细胞中MEK1、MEK2和ERK1/2的mRNA水平及磷酸化蛋白水平均高于对照组(P<0.05)。 结论: 糖尿病小鼠肠上皮细胞过度增殖可能与其中胰岛素受体亚型IR-A/IR-B的比值增高及其相关MEK/ERK通路的激活有关。

[关键词]糖尿病； 肠上皮细胞； 胰岛素受体； 细胞增殖

近年来，我国糖尿病(diabetes mellitus，DM)的患病率迅速增长，而糖尿病肠病作为DM常见的并发症之一也越来越受到关注。DM患者中有大约10%～20%具有消化道症状，主要表现为胃肠道的功能障碍，如腹胀、顽固性腹泻和吸收不良等。越来越多的研究发现，糖尿病肠病患者的肠道除了功能异常，其肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)还呈现出过度增殖的状态，但其机制尚未完全阐明[1-2]。

胰岛素受体(insulin receptors，IR)在体内广泛分布于肝脏、脂肪、肌肉、肠道上皮等组织中，其结构与胰岛素样生长因子1受体相似，具有IR-A和IR-B 2个亚型，其亚型比例的改变与后续下游信号通路的活化密切相关[3-4]。近年来许多研究发现胰岛素样生长因子与细胞增殖、分化及多种肿瘤的发生有关，而IR是胰岛素样生长因子系统的重要组成部分，这提示着IR亚型比例的改变也可能在细胞增殖、分化及肿瘤的发生发展过程中也起着重要的作用[5-6]。然而，目前IR受体亚型比例改变对促进DM肠道上皮细胞增殖作用的研究报道较少，具体机制尚不明确。因此，本研究旨在观察IR受体亚型的改变及其下游相关通路的活化情况与DM小鼠IECs过度增殖的关系。

材料和方法

1主要试剂

链脲霉素购自Sigma；EDTA和DTT购自上海碧云天生物技术有限公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、IR、相关MEK/ERK和PI3K/Akt通路中关键分子的多克隆抗体，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，U0126均购自CST；TRIzol®试剂盒购自Life Technology； mRNA逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa；ECL试剂盒购自Santa Cruz；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯；相关引物由上海生工生物工程技术服务有限公司根据设计合成。

2实验动物

实验动物为SPF级C57BL/6J小鼠，共40只，雌雄各半，鼠龄8周，体重19～20 g，购于中山大学实验动物中心，实验动物的所有实验过程均在中山大学实验伦理委员会的监督指导下完成，符合实验动物伦理学要求。

3主要方法

3.1DM小鼠模型的建立及处理40只C57BL/6J小鼠随机分为2组，一组为DM组(30只)，另外一组为正常对照组(10只)。DM组小鼠给予腹腔内注射链脲霉素(70 mg/kg)，每天1次，连续5 d，正常对照组给予相同体积的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液腹腔注射，每天1次，连续5 d。小鼠血糖值随机测得大于16.7 mmol/L至少超过3次，并持续稳定在该水平以上为DM小鼠造模成功[7]。于第10周时发现30只DM小鼠血糖仍维持在16.7 mmol/L以上，选取DM小鼠与正常对照小鼠各10只断颈处死，沿腹部正中线切开腹腔，分离完整小肠(从幽门至回盲部)进行后续研究。

选取造模成功的DM小鼠20只，随机分为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)组(10只)和U0126组(10只)。其中U0126为MEK激酶抑制剂，特异性抑制MEKK1激活，抑制MAPKs级联反应，溶解于DMSO，经尾静脉注射(4 d注射1次)，连续10周。

3.2PCNA法测定肠上皮细胞增殖指数将4%多聚甲醛固定后的小肠组织进行石蜡包埋，制备组织切片。切片组织经常规脱蜡、水化，过氧化酶阻断剂孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，PCNA I抗(1∶250稀释)4 ℃孵育过夜，II抗37 ℃室温孵育30 min，链霉素抗生物素-过氧化物酶孵育10 min，DAB显色5 min，磷酸盐缓冲液终止显色，苏木素复染30 s，常规脱水、封片后置于显微镜下观察。光镜下观察PCNA阳性细胞的位置及表达情况。在400倍的观察条件下，计算每个视野中小肠隐窝内PCNA阳性细胞的数目。随机选择10个视野计数分析，取均值做后续统计。

3.3原代小鼠IECs的分离及鉴定去除小肠系膜，沿纵轴切开小肠，用预冷的无菌PBS清洗数次，加入分离液I(DPBS + 30 mmol/L EDTA + 1.5 mmol/L DTT)，冰上放置20 min，之后将整段小肠转移至分离液II(DPBS + 30 mmol/L EDTA)中，37 ℃水浴10 min，剧烈摇晃30 s，弃去残留的肠段，将余下的液体以2 500 r/min离心5 min，沉淀重悬于10 mL的PBS中，重复该步骤2次。沉淀重悬液为所分离的小肠上皮细胞，在倒置显微镜下进行观察。对上述分离到的原代小肠上皮细胞进一步消化,制备单细胞悬液, 以 CD24 作为 IECs 的表面标志，以 CD45 作为混杂的间质细胞的表面标志, 分别在 PE 及 APC 荧光抗体标记后,使用流式细胞仪分选CD24lowCD45-细胞组分。

3.4半定量RT-PCR及real-time PCR提取上述两组IECs总RNA，采用分光光度法测定总RNA质量及浓度。各取0.5 μg总RNA，逆转录成cDNA。按照下述条件行IR的PCR分析(共35个循环)：94 ℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min。回收PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及半定量分析IR-A/IR-B的比值。采用2.5%琼脂糖凝胶，电泳条件为90 V(恒压)电泳30 min，结束后进行凝胶图像记录及分析。Real-time PCR按照试剂盒说明书进行，反应条件为95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min,共40个循环。以18S rRNA为内参照计算基因的相对表达量。PCR反应的引物序列见表1。

表1　PCR的引物序列

3.5Western blot实验收集上述各组的IECs，用组织蛋白裂解液裂解细胞，置于冰上30 min，然后12 000 r/min离心20 min。用BCA法测定总蛋白浓度。定量后上样，进行SDS-PAGE，然后以200 mA恒流电转2 h后，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入I抗(IR、p-MEK、MEK、p-ERK、ERK、PI3K、p-Akt和Akt均为1∶1 000稀释；β-actin为1∶5 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，在HRP标记的II抗(1∶5 000稀释)中室温孵育1 h，TBST洗4遍，曝光、显影与定量分析。

4统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用独立样本的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1DM小鼠小肠上皮增殖过度

采用免疫组化染色的方法对DM组及对照组小鼠小肠上皮表达PCNA的情况进行了测定。结果显示，DAB染色阳性的细胞主要分布于两组小肠上皮隐窝的底部及下段。与对照组小鼠相比，DM小鼠小肠上皮组织PCNA增殖指数显著升高，见图1。

Figure 1.Abnormal proliferation of IECs in the DM mice (PCNA immunohistochemical staining,×400, scale bar=25 μm). The arrow heads indicate PCNA positive cells.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

图1DM小鼠小肠上皮组织出现增殖过度的改变

2原代小鼠IECs的鉴定

采用EDTA分离及差异离心法分离到的原代小鼠IECs组分中含有大量隐窝细胞及绒毛。流式细胞技术的检测结果显示，原代分离的小鼠IECs中CD24lowCD45-细胞比例为10.99%，见图2。

3DM小鼠原代IECs中IR表达上调及IR亚型比例改变

Western blot实验结果显示，DM组小鼠小肠上皮表达IR的蛋白质水平显著高于对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示，DM小鼠的原代IECs内IR亚型IR-A/IR-B的比值高于正常对照小鼠(P<0.05)，见图3。

4DM小鼠小肠上皮内IR下游相关通路MEK/ERK及PI3K/Akt的变化

MEK/ERK及PI3K/Akt通路是IR下游重要的相关信号通路。结果显示，DM组小肠上皮内MEK1、MEK2和ERK1/2的mRNA水平表达均较正常对照组明显升高(P<0.05)。蛋白质水平上，DM组小肠上皮内磷酸化状态的p-MEK1/2及p-ERK1/2与其总的表达水平的比值也较正常组明显升高(P<0.05),见图4A、B。

Figure 2.The identification of primary IECs of mice (×400,scale bar=25 μm).The arrow head indicates intestinal crypt cell, while the arrow indicates intestinal villus cell.

图2原代小鼠IECs的鉴定

另一下游通路的重要分子PI3K和Akt的mRNA水平在DM组和对照组小肠上皮内的表达之间无显著的统计学差异。蛋白质水平上，PI3K、Akt及p-Akt的水平在两组间的差异无统计学显著性，见图4C、D。

Figure 3.The IR protein expression (A) and IR-A/IR-B mRNA ratio (B) in the IECs of DM mice. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

图3DM小鼠IEC高表达IR及IR亚型比例改变

Figure 4.The activation of MEK/ERK (A，B) and PI3K/Akt(C，D) pathways in the IECs of DM mice. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group.

图4IR下游相关通路MEK/ERK及PI3K/Akt的活化情况

5U0126对糖尿病小鼠IECs中MEK/ERK通路的影响及其对糖尿病小鼠IECs异常增殖的影响

U0126是MEK激酶抑制剂，特异性抑制MEKK1激活，抑制MAPKs级联反应。Western blot结果显示，U0126组小鼠小肠上皮内磷酸化状态的p-MEK1/2及p-ERK1/2与其总蛋白水平的比值也较DMSO组明显升高(P<0.05)。免疫组化显示，与DMSO小鼠相比，U0126组小鼠小肠上皮组织的PCNA增殖指数显著降低(P<0.05)，见图5。

Figure 5.Down-regulation of the MEK/ERK pathway by U0126 (A) normalized the abnormal proliferation (B) of IECs in DM mice (PCNA immunohistochemical staining,×400, scale bar=25 μm). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsDMSO group.

图5U0126对糖尿病小鼠IECs中MEK/ERK通路的影响及其对糖尿病小鼠IECs异常增殖的影响

讨论

糖尿病肠病作为糖尿病患者常见并发症之一，其发病机制可能为内脏神经疾患、肠道的运动功能失常、肠道菌群失调、肠道激素分泌紊乱等。此外，Sano等及本研究组均发现，糖尿病患者除了表现出胃肠功能障碍的临床表现，还存在罹患肠道肿瘤的风险增加及结肠上皮过度增殖的现象[7-9]。这些研究提示了糖尿病患者肠道上皮增殖过度也是一个重要的病理改变，但其具体的机制尚未完全阐明。

本次研究以本研究组既往成果为基础，采用PCNA标记法评价DM小鼠及对照组小鼠小肠上皮细胞的增殖情况。结果显示，DM小鼠小肠上皮组织中PCNA阳性细胞均位于隐窝下段及底部，同时，增殖指数明显高于正常对照小鼠，进一步证实了DM小鼠肠道存在增殖过度的现象[7]。目前，DM导致肠上皮细胞异常增殖的具体机制未明，过去的研究发现，胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)在DE肠上皮异常增殖过程中起着重要的作用[10]。另有研究也发现，肠上皮隐窝中的Paneth细胞分泌的EGF可在局部作用于临近的肠上皮干细胞并促进后者的增殖和分化[11]。DM状态下肠上皮细胞的异常增殖是个很复杂的过程，上述提到的研究成果可能只是其机制的一部分，其具体机制尚有待进一步的研究。

IR属于酪氨酸激酶超家族，由2个α亚基和2个β亚基共同组成四聚体跨膜糖蛋白。IR有2种亚型：缺少外显子11的IR-A和包含外显子11的IR-B，这两者由IR转录蛋白选择性剪切而来[12]。胰岛素与IR胞外的α亚基结合后，激活IR的酪氨酸激酶自身磷酸化，然后通过2条主要信号通路发挥生物学作用：(1) PI3K/Akt通路，PI3K由一个调节亚基p85和一个催化亚基p110组成，通过磷酸肌醇依赖性激酶1使Akt活化，激活Akt下游一些酶的活化，如GSK-3、蛋白激酶C等，参与蛋白质的合成和细胞的增殖、分化；(2) MEK/ERK通路。IR活化后可以激活Ras，Ras是一个具有GTP酶活性的GTP结合蛋白，和GTP结合后，活化的Ras可募集激活甘/丝氨酸激酶Raf至细胞膜，继而激活MEK激酶，再进一步磷酸化甘氨酸/丝氨酸残基激酶ERK1/2，ERK1/2转移至细胞核内调节细胞增殖相关基因的转录，以控制蛋白合成和细胞生长[13]。这2条通路是IR发挥其生物学效应的主要途径。

为进一步阐明DM小鼠IECs出现过度增殖的机制，我们对IR受体亚型的表达及下游的MEK/ERK、PI3K/Akt通路进行了测定。结果显示，IR-A/IR-B的比值在DM组显著增高，这一表达特征与其在一些高度增殖状态的细胞中表达的情况相一致，如乳腺癌、结肠癌、肺癌等[14]。而接下来对于IR下游2条主要与细胞增殖有关通路活化情况的研究表明，与对照组相比，DM小鼠IECs中MEK/ERK通路的活化状态显著升高，而PI3K/Akt通路却与对照组水平一致，无明显改变。进一步的研究结果表明，利用U0126抑制MEK/ERK通路能有效降低DM小鼠IEC的异常增殖。这一结果提示，在DM小鼠IECs增殖过度的过程中IR亚型改变(IR-A亚型上调)所激发的下游通路是MEK/ERK通路，这一通路的激活直接引起了DM小鼠IECs的过度增殖,相反，另外一条通路——PI3K/Akt通路在DM中并未受到激活，说明其与这一病理改变关系不大。然而，更深入的调控机制还需要在今后的研究中进一步完善。

综上所述，DM小鼠小肠上皮出现了IR亚型比例的改变(IR-A亚型相对上调)，这一改变可能通过激活下游的MEK/ERK通路导致小肠上皮出现增殖过度，而使用MEK/ERK通路抑制剂U0126能有效抑制这种异常增殖，这一结果为临床上DM患者肠道肿瘤高发的研究提供了实验基础。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

MEK/ERK pathway activated by changing insulin receptor isoform is associated with abnormal proliferation of intestinal epithelial cells in diabe-tic mice

OUYANG Hui, XIA Zhong-sheng, YANG Hong-sheng, YU Tao, LU Xi-ji, XU Ji-hao, CHEN Qi-kui

(DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:yutao2014@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of insulin receptor (IR)-A/IR-B ratio and the downstream pathway in abnormal proliferation of intestinal epithelial cells (IECs) in diabetic mice. METHODS: Diabetes mouse models were induced by intraperitoneal streptozocin injection. The proliferating cell nuclear antigen (PCNA) proliferation rates in the small intestine tissue were evaluated by immunohistochemical methods. The expression of IR isoforms was detected by RT-PCR. To ensure that the downstream pathways of IR are involved, real-time PCR and Western blot were performed to detect the expression of MEK1/2, ERK1/2, PI3K and Akt. RESULTS: In diabetic mice, the PCNA proliferation rates were higher than those in control group (P<0.05), and a high ratio of IR-A/IR-B was detected in the IECs (P<0.05). The mRNA expression of MEK1, MEK2, ERK1/2 and their phosphorylated protein levels in the diabetic mice were significantly higher than those in control group (P<0.05). CONCLUSION: The over-proliferation of IECs in the diabetic mice is associated with high IR-A/IR-B ratio and up-regulation of IR/MEK/ERK pathway.

[KEY WORDS]Diabetes mellitus; Intestinal epithelial cells; Insulin receptor; Cell proliferation

[文章编号]1000- 4718(2016)05- 0874- 06

[收稿日期]2015- 11- 09[修回日期] 2016- 01- 11

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81370475)

通讯作者△Tel: 020-81332598; E-mail: yutao2014@126.com

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.018

杂志网址： http://www.cjpp.net