女贞不同部位中总皂苷的含量测定及提取工艺

李启照

（安徽新华学院药学院，安徽合肥230088）

女贞不同部位中总皂苷的含量测定及提取工艺

李启照

（安徽新华学院药学院，安徽合肥230088）

采用正交试验等技术方法对女贞的根皮、茎皮及叶子中总皂苷的含量及提取工艺进行分析.研究结果表明，最佳提取工艺条件为：提取时间2 h、料液比1：20、乙醇浓度75%、提取温度60℃.其根皮、茎皮和叶子中总皂苷含量分别为1.934%、1.667%和1.382%.通过精密度试验等方法学考察，说明该提取工艺精确、稳定、可靠.

女贞；总皂苷；提取工艺；正交试验；含量

女贞为木犀科常绿植物，种子含有三萜类、多糖类、皂苷类、黄酮类活性成分，具有降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、滋阴补肾、增强免疫和抗肿瘤等多种药理作用.近年来，有关女贞的药理方面研究较多，但对女贞不同部位（叶、茎皮、根皮）中皂苷含量研究较少.本实验采用单因素和正交试验利用回流方法对女贞茎皮、根皮、叶子中皂苷活性成分进行提取纯化、测定，为女贞全株有效成分利用开发提供研究基础.

1 材料与仪器试剂

女贞（Ligustrum lucidum）实验材料采自安徽新华学院校内，由刘金旗教授鉴定.人参皂苷Re与齐墩果酸对照品均购自中国药品生物制品鉴定所，甲醇、乙醇、正丁醇等均为分析纯.主要仪器包括UV-2102 PCS型紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司），SHB—111循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），R-200旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司），METFLERAE 240分析天平（上海托利多一梅特勒仪器有限公司）等.

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 女贞中皂苷提取方法考察

2.1.1.1 微波法提取

将女贞的根皮、茎皮、叶子洗净，干燥，粉碎，过40目筛，收集备用.准确称取干燥的根皮、茎皮、女贞叶粉各5.0 g，分别放置在三个100 ml的锥形瓶中.然后各准确加入25 ml 75%乙醇，微波提取30 min，收集提取液；继续加75%乙醇25 ml，微波30 min，离心过滤，收集提取液，减压浓缩，残渣用蒸馏水溶解，用20 ml水饱和的正丁醇萃取3-5次，合并醇层溶液再用60 ml氨试液（正丁醇饱和）萃取2-3次，合并醇层水浴蒸干，用甲醇溶解残渣，5 ml定容，待测.每个样品重复提取3次.

2.1.1.2 超声法提取考察

精密称取女贞根皮、茎皮、叶子粗粉各5.0 g，分别放置在3个100 ml圆底烧瓶中，各加25 ml 75%乙醇，浸泡30 min，然后分别超声提取30 min，减压过滤，残渣用蒸馏水溶解，用20 ml水饱和的正丁醇萃取3-5次，合并醇层溶液再用60 ml氨试液（正丁醇饱和）萃取2-3次，合并醇层水浴蒸干，用甲醇溶解残渣，5 ml定容，待测.每个样品重复提取3次.

2.1.1.3 乙醇回流提取法考察

精密称取女贞根皮、茎皮、叶子粗粉各5.0 g，分别加50 ml 75%乙醇，60℃水浴回流2次，每次1 h，过滤，挥干，残渣用蒸馏水溶解，用20 ml水饱和的正丁醇萃取3-5次，合并醇层溶液再用60 ml氨试液（正丁醇饱和）萃取2-3次，合并醇层水浴蒸干，用甲醇溶解残渣，5 ml定容，待测.每个样品重复提取3次.

2.1.2 对照品溶液的制备

准确称取对照品人参皂苷Re和齐墩果酸各5 mg，分别加甲醇溶解并定容至10 ml，制成5 mg/ml作为对照品溶液.

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取女贞根皮、茎皮、叶子粗粉各5.0 g，分别加50ml 75%乙醇，60℃水浴回流2次，每次1 h，过滤，挥干，残渣用蒸馏水溶解，用20 ml水饱和的正丁醇萃取3-5次，合并醇层溶液再用60 ml氨试液（正丁醇饱和）萃取2-3次，合并醇层水浴蒸干，用甲醇溶解残渣，50 ml定容，为供试品溶液.

2.1.4 最大吸收波长的确定

分别精密吸取人参皂苷Re、齐墩果酸对照品溶液0.24、0.30、0.36、0.42、0.48 ml，放置在10 ml具塞磨口刻度试管中，取供试品溶液0.10、0.16 ml，分别置于10 ml具塞磨口刻度试管中，水浴挥干，加0.4 ml新鲜配置的5%香草醛-冰乙酸溶液、1.6 ml高氯酸、密塞，摇匀，60℃水浴20 min，室温流水中放置10 min，加冰乙酸至5 ml，摇匀.以同法配置的空白溶液作参比，在紫外分光光度计上200-800 nm范围内扫描.结果显示，人参皂苷在525nm波长处有最大吸收，齐墩果酸在545 nm波长处有最大吸收[1].因此，人参皂苷的测定波长为525 nm，齐墩果酸的测定波长为545 nm.

2.1.5 标准曲线的绘制

2.1.5.1 齐墩果酸标准曲线

精密吸取齐墩果酸储备液5 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，分别取0.6、1.2、1.8、2.4、3、3.6 ml，放置在干燥具塞试管中挥去甲醇，各加入新鲜配置的5%香草醛-冰醋酸0.4 ml和1.6 ml高氯酸，摇匀置于80℃水浴中加热20 min，取出，用冰水冷却至室温，加10 ml乙酸乙酯，摇匀，以相同试剂为空白.在545 nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以齐墩果酸含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线.计算回归方程为Y=1.027x+0.03256，相关系数r=0.9998.

2.1.5.2 人参皂苷Re标准曲线

精密吸取人参皂苷储备液5 ml于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，分别取0.6、1.2、1.8、2.4、3、3.6 ml，于干燥具塞试管中挥去甲醇，各加入0.4 ml新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸和1.6 ml高氯酸，摇匀置于80℃水浴中加热20 min，取出，用冰水冷却至室温，加10 ml乙酸乙酯，摇匀，以相同试剂为空白[3].在525 nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以人参皂苷Re含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线.计算回归方程为Y=2.8202x+ 0.0511，相关系数r=0.9994，人参皂苷Re在0.062～0.37 mg范围内线性关系良好.

2.1.6 不同提取方法皂苷含量测定

精密吸取上述不同方法提取的女贞根皮、茎皮、叶子提取液各10ml，根据标准曲线制备项下方法进行测定，依据回归方程计算其中总皂苷含量，以人参皂苷Re，齐墩果酸为对照品，不同提取方法女贞根皮、茎皮、叶子含量如表1～3.

表1 不同提取方法根皮总皂苷含量测定结果

表2 不同提取方法茎皮总皂苷含量测定结果

表3 不同提取方法叶子总皂苷含量测定结果

由表1～3可知，乙醇回流提取法对女贞根茎叶皂苷含量提取率均高于超声和微波提取法，因此，本实验采用的提取方法是乙醇回流提取法，并且对乙醇回流方法进行单因素正交实验考察.

2.2 薄层鉴别分析

2.2.1 供试品溶液的制备

将烘干的女贞根皮、茎皮、叶子粉碎，过40目筛；分别称取5.0 g放在3个锥形瓶中，加50 ml乙醇，超声处理30 min，滤过，滤液于水浴上挥干，残渣加20 ml蒸馏水溶解后置于分液漏斗中加水饱和正丁醇萃取三次，每次20 ml，合并正丁醇层，再用60 ml正丁醇饱和的氨试液分3次萃取，合并正丁醇层与水浴上挥干，残渣加甲醇溶解，定容至50 ml，作为供试品溶液.

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品齐墩果酸和人参皂苷Re各5 mg，分别加5 ml甲醇溶液.配制为对照品溶液.

2.2.3 薄层色谱鉴别

精密吸取齐墩果酸对照品溶液10 μl、人参皂苷Re对照品溶液10 μl，根皮供试品10 μl、茎皮供试品溶液15 μl、叶子供试品20 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，将点好样品的薄层板放入有丙酮∶氯仿（1∶1）展开剂中展开，待展开至规定距离展开约10 cm，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液于105℃烘至显色清晰，置紫外光灯（365 nm）和日光下检视.检测样品的色谱图和对照样品的相应位置，显示相同的颜色点图1.

2.3 紫外分光光度法测定总皂苷含量

2.3.1 含量测定

分别精密称取根皮、茎皮、叶子粗粉各2.0 g于锥形瓶中，按“2.2.1”方法制备供试液，在525 nm处测定吸光度，计算含量，结果见表4.结果表明：根皮中的总皂苷含量最高，其次为茎皮，叶子中总皂苷含量最低.因此本实验只对女贞根皮皂苷提取工艺进行考察实验.

图1 女贞薄层色谱图

表4 女贞不同部位总皂苷含量测定结果（n=3）

2.3.2 精密度试验

精密移取5份人参皂苷标准品溶液各2 ml，按上述方法显色后测定吸光度，结果吸光度的平均值为0.512，RSD为0.44%，表明仪器的精密度是良好的.

2.3.3 重复性试验

取根皮粗粉5份，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述方法显色后，测定吸光度，计算总皂苷含量，结果平均含量为19.87%，RSD为1.7%，表明本方法重复性良好[2].

2.3.4 稳定性试验

取供试品溶液分别于0、0.5、1、1.5、2 h测其吸光度，结果吸光度的平均值为0.623，RSD为2.9%，表明样品在2.0 h内稳定性良好.

2.4 女贞总皂苷提取因素实验研究

2.4.1 提取时间的考察

准确称取4份5.0 g根皮粗粉，置于4个圆底烧瓶中，加入75%乙醇100 ml，60℃水浴回流，回流的时间为1、1.5、2、2.5 h，将提取液过滤，挥干，再分别用甲醇溶液溶解过滤，定容至50 ml，其他因素不变，按上述方法在525 nm处测定吸光度值.实验结果见表5所示.

表5 不同提取时间总皂苷的含量

由表5可知，女贞根皮的总皂苷提取率随提取时间的增加而增加，但随时间增加不成正比.综合考虑，选择提取时间为2 h.

2.4.2 提取温度的考察

准确称取4份5.0 g根皮粗粉，置于4个圆底烧瓶中，加入75%乙醇100 ml，分别置于40、50、60、70℃水浴上回流2 h，将提取液过滤，挥干，再分别用甲醇溶液溶解过滤，定容至50 ml，其它因素不变，按上述方法在525 nm处测定吸光度值[3].实验结果见表6所示.

由表6可知，随着温度的增加，女贞根皮的总皂苷提取率也会增加，但温度超过60℃时，提取率变化不大.综合考虑，选择60℃.

表6 不同提取温度总皂苷的含量

2.4.3 料液比的考察

准确称取4份5.0 g根皮粗粉，置于4个锥形瓶中，分别加入50 ml、100 ml、150 ml、200 ml 75%乙醇，水浴回流2 h，将提取液过滤，挥干，再分别用甲醇溶液溶解过滤，定容至50 ml，其他因素不变，按上述方法在525 nm处测定吸光度值.实验结果见表7所示.

表7 不同料液比总皂苷的含量

由表7可知，其提取率随料液比增加不成正比，但料液比越大一般提取率越高，1：20与1：30相差不明显.综合考虑，最终选择料液比1：20.

2.4.4 乙醇浓度的考察

准确称取4份5.0 g根皮粗粉，置于4个锥形瓶中，分别用浓度为55%、65%、75%、85%的乙醇水浴回流2 h，将提取液过滤，挥干，再分别加甲醇溶液溶解过滤，定容至50 ml，其他因素不变，按上述方法在525 nm处测定吸光度值.实验结果见表8所示.

表8 不同浓度乙醇提取皂苷结果

从表8可知，随着乙醇浓度的增加，女贞的整体提取率会升高.其中选择乙醇浓度为75%提取效果较好.

2.5 女贞提取工艺条件因素正交试验

上述实验针对的是对女贞提取有单方面影响的因素，但从实际生产考虑各影响因素的相互影响也会影响女贞中总皂苷提取率的[4].因此，要充分考虑物料的料液比、提取次数、萃取时间、乙醇浓度等的特殊设计，通过正交试验，找出最佳提取条件，然后进行工业发展.

2.5.1 正交试验设计

试验采用L9（34）正交方案，分别对提取时间、提取次数、料液比量、乙醇浓度等因素进行正交试验，因素水平安排见表9.

表9 正交试验因素水平表

2.5.2 试验结果与数据分析

由表10可知，对女贞总皂苷提取率的影响因素大小顺序为提取次数（A）＞提取时间（B）＞料液比（C）＞乙醇浓度（D）.所以，因素A对指标的影响极显著，而因素D对指标的影响不显著.最终得出最佳的因素组合为A2B2C3D1.但根据实际生产考虑，最终选择A2B2C2D1较好.所以，提取女贞总皂苷的最佳工艺条件为：乙醇浓度75%、提取次数2次、提取时间2 h、料液比为1：20.

表10 正交试验表

3 结论

本实验通过对女贞根茎叶皂苷提取方法、微波、超声法、乙醇回流法等提取方法进行比较，得出乙醇回流法＞微波法＞超声法.因此，本实验采用乙醇回流提取女贞根茎叶中皂苷成分.通过上述实验可以得出女贞根皮、茎皮、叶子中均含有皂苷类成分，其中根皮中的总皂苷含量最高为1.934%.综合考虑，女贞总皂苷的最佳提取工艺条件为提取时间2 h、料液比1：20、乙醇浓度75%、提取温度60℃.通过方法学实验考察表明，该工艺简单快速，得率较高，稳定性较好，使用试剂单纯，方法可行，是女贞根茎叶皂苷成分提取较佳工艺条件.本实验在第一次提取时应考虑药材吸水性；在测定吸光度时冰水冷却后要快速测定时间过长对测定结果影响较大.皂苷种类较多对不同类型皂苷组成、提取分离有待今后进一步实验.为女贞综合利用开发提供更好的研究基础.

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Analysis on the Total Saponins Content and Extraction Conditions in Different Parts ofLigustrum Lucidum

LI Qi-zhao
（School of Pharmacy，Anhui Xinhua University，Hefei，Anhui 230088）

The extraction conditions and content of saponins in the different parts（root bark,stem bark and leaves）ofligustrum lucidumwere studyed using orthogonal experiment and other technical methods.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows∶extraction time 2 h，solid-liquid ratio 1：20，ethanol concentration 75%，extraction temperature 60℃.Saponins content in the root bark，stem bark and leaves was 1.934%，1.667%and 1.382%，respectively.The extraction conditions were accurate，stable and reliable using experimental methods such as precision test etc.

Ligustrum lucidum；total saponins；extraction condition；orthogonal test；content

Q946

A

1671－9743（2016）11－0001－05

2016-08-08

安徽教育厅自然科学研究项目（KJ2015A307）；安徽新华学院校级质量工程（2012xwsjx072013xqjdx01；2015xqjdx04；2015xxk06）.

李启照，1970年生，男，安徽金寨人，讲师，研究方向：药物合成研究.