酶联免疫法检测自身免疫性肝炎I型抗纤维肌动蛋白抗体的评估

刘 玲，黄 洁，彭晓明，肖明中，李晓东

湖北省中医院1.检验科；2.肝病科，湖北 武汉 430061

酶联免疫法检测自身免疫性肝炎I型抗纤维肌动蛋白抗体的评估

刘 玲1，黄 洁1，彭晓明1，肖明中2，李晓东2

湖北省中医院1.检验科；2.肝病科，湖北 武汉 430061

目的 对使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)Ⅰ型患者抗纤维肌动蛋白抗体(AFA)进行评估分析。方法 收集163例AIH-Ⅰ型、15例AIH-Ⅱ型、36例AIH-Ⅲ型患者临床资料及血清标本，采用ELISA法检测患者的AFA，同时采用间接免疫荧光法(IFA)检测患者的AFA和抗平滑肌抗体(ASMA)作为对照，对检测结果进行统计学分析。结果 以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U为阳性判断标准，除AFA-ELISA与ASMA-IFA检测AIH-Ⅱ型的阳性例数差异有统计学意义外(P=0.03)，AFA-ELISA与AFA-IFA、ASMA-IFA比较，检测其他AIH各型患者阳性例数差异均无统计学意义(P﹥0.05)。AFA-ELISA与AFA-IFA检测AIH-Ⅰ型的相关性比ASMA-IFA更好(r=0.97vs0.52)。AFA-ELISA与AFA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特异性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA与ASMA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特异性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA 检测AIH-Ⅰ型的约登指数与AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25)。AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的ROC面积为0.86，当浓度为54.06 U/ml时检测的敏感性和特异性最好。结论 AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的敏感性和特异性与AFA-IFA相近，但操作更方便，与ASMA-IFA的敏感性相近，但特异性更好。AFA-ELISA可作为AIH-Ⅰ型较好的筛查方法。

自身免疫性肝炎；抗纤维肌动蛋白抗体；抗平滑肌抗体；酶联免疫吸附试验；间接免疫荧光法

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)Ⅰ型是一种慢性进行性肝脏疾病，免疫抑制剂能有效控制部分患者病情的发展，如果不能正确诊断和及时有效治疗，最终可导致肝硬化、肝功能衰竭，因而早期准确诊断是关键[1]。抗纤维肌动蛋白抗体(anti-filamentous actin antibody,AFA)近年来备受关注，被认为对AIH-Ⅰ型具有较好的诊断价值[2-3]，但目前对AIH自身抗体的检测方法亟待规范[4-5]。我们使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测AIH患者的AFA，并将检测结果与其他数据比较分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2010年12月-2014年12月湖北省中医院确诊的163例AIH-Ⅰ型、15例AIH-Ⅱ型、36例AIH-Ⅲ型肝病患者临床资料及血清标本，AIH患者中凡伴有其他自身免疫性疾病如自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、干燥综合征、类风湿关节炎的均排除在外。另收集197名健康献血者标本作为对照组，收集血清后分装，-80 ℃冻存备用。研究对象均保留详细的临床资料，且签订知情同意书。

1.2 观察指标(1)临床表现：包括性别、年龄、临床症状；(2)影像学检查：观察患者初诊时肝脏情况；(3)血清生化指标检测：丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清总胆红素(TBil)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、球蛋白(GLO)、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)；(4)AIH自身抗体：ANA、AFA、ASMA；(5)肝脏组织病理学检查：AIH、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、重叠综合征(AIDOS)患者于诊断前行肝穿刺活检，评价病理组织学特点。

1.3 方法

1.3.1 AIH的诊断：结合国际自身免疫性肝炎工作组(International AIH Group，IAIHG)1992年AIH诊断评分标准[6]、1999年AIH修订诊断评分标准[7]和2008年AIH简化评分标准[8]进行评分。主要内容有：(1)无遗传代谢类疾病(α1抗胰蛋白酶及血清铜蓝蛋白指标正常)、无活动性病毒感染、无饮酒或服用已知对肝脏有损伤的药物史；(2)AST、ALT显著升高，免疫球蛋白IgG升高大于正常上限；(3)自身抗体阳性，包括ANA、AFA、ASMA、抗LKM-1、抗LC-1、抗SCA/LP；(4)肝脏病理学表现以界面肝炎为主，无胆管的病理改变。

1.3.2 AIH分型：已经诊断的AIH患者参考相关标准[13]，按照患者自身抗体的检测情况进行分型。

1.3.3 ELISA法检测AFA：选用美国INOVA公司提供的ELISA试剂，标本用标本稀释液1∶1稀释后加入50 μl于反应孔内，立即加入50 μl的生物素标记的抗体。盖上膜板轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h，甩去孔内液体，洗净拍干。每孔加入80 μl的亲和链酶素-HRP，37 ℃温育30 min。甩去孔内液体，洗净拍干。每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃温育10 min。取出酶标板迅速加入50 μl终止液，在450 nm波长处测定各孔的OD值。以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的α-ASMA标准品浓度为横坐标(X)获得相应曲线，根据OD值由标准曲线换算出浓度。浓度≥30 U判定为阳性，浓度<20 U判定为阴性，浓度20～30 U判定为可疑。

1.3.4 IFA法检测AFA和ASMA：AFA和ASMA试剂均为欧蒙(德国)医学实验诊断公司生产的Hep-2细胞生物薄片。选择Hep-2细胞、猴肝、大鼠肾、大鼠胃作基质的生物薄片，将待测血清稀释与基质常温孵育30 min，PBS缓冲液浸洗5 min，加异硫氰酸荧光素标记的抗体常温孵育30 min，PBS缓冲液浸洗5 min后封片，用荧光显微镜观察结果。

2 结果

2.1 一般情况及临床表现AIH-Ⅰ型组的平均年龄为(59.26±10.24)岁，AIH-Ⅱ型组为(66.54±8.21)岁，AIH-Ⅲ型组为(63.38±12.92)岁。AIH患者中女性多于男性(女男比例3.28∶1)，大多隐袭性起病，临床症状及体征各异。常见症状包括乏力、恶心、呕吐、上腹部不适或疼痛、关节痛、肌痛、皮疹等。部分患者无明显临床症状及体征，只有在生化检查出肝功能异常后才发现。少数患者表现为急性、亚急性甚至暴发性起病。

2.2 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA检测AIH患者结果统计IFA≥1∶320、ELISA≥30 U检测例数，AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的阳性例数与AFA-IFA、ASMA-IFA比较，差异均无统计学意义(χ2=0.25，P=0.62；χ2=1.22，P=0.27)；检测AIH-Ⅱ型的阳性例数与AFA-IFA比较，差异无统计学意义(χ2=0.24，P=0.62)，但与ASMA-IFA比较，差异有统计学意义(χ2=5.0，P=0.03)；检测AIH-Ⅲ型的阳性例数与AFA-IFA、ASMA-IFA比较，差异均无统计学意义(χ2=0.69，P=0.41；χ2=2.17，P=0.14)；检测健康献血者的阳性例数与AFA-IFA、ASMA-IFA比较，差异均无统计学意义(χ2=0.34，P=0.56；χ2=0.20，P=0.65，见表1)。

表1 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA检测AIH患者结果[例数(%)]

注：以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U分析同型AIH患者：*P>0.05、#P<0.05。

2.3 AFA-ELISA与AFA-IFA、ASMA-IFA检测AIH-Ⅰ患者结果相关性分析通过SPSS 19.0相关性分析，AFA-ELISA与不同滴度ASMA-IFA的相关性为：r=0.52，0.95%CI：0.17～0.81，P<0.05(见表2)。AFA-ELISA与不同滴度的AFA-IFA的相关性为：r=0.97，0.95%CI：0.93～0.99，P<0.001(见表3)。AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型与不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相关性，但与AFA-IFA的相关性更好(r=0.97vs0.52)。

表2 AFA-ELISA对ASMA-IFA阳性AIH-I型患者检测结果 [例数(%)]

表3 AFA-ELISA对AFA-IFA阳性AIH-I型患者检测结果[例数(%)]

2.4 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA检测AIH-Ⅰ型的性能评估将全部AIH作为统计对象，AFA-ELISA检出的真阳性数为124例、真阴性数为37例；AFA-IFA检出的真阳性数为116例、真阴性数为40例；ASMA-IFA检出的真阳性数为105例、真阴性数为31例。AFA-ELISA 与AFA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特异性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA与ASMA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特异性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的约登指数与AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25，见表4)。

表4 AFA-ELISA、AFA-IFA和ASMA-IFA检测AIH-Ⅰ型的性能评估

2.5 AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的ROC曲线运用SPSS 19.0统计软件绘制受试者工作曲线，以检测结果的1-特异性为横坐标，敏感性为纵坐标绘制曲线，曲线下面积为0.86，当浓度为54.06 U/ml时检测AFA-ELISA的敏感性、特异性最好(见图1)。

图1 AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的ROC曲线

3 讨论

随着临床实践经验的积累和对AIH-Ⅰ型认识的提高，人们逐渐认识到AIH-Ⅰ型相关性自身抗体在AIH-Ⅰ型的诊断与分型中的重要作用[9]。AIH-Ⅰ型自身抗体的临床意义不仅体现在疾病诊断上，某些自身抗体在反映疾病活动度、监测病程、评价疗效和预后判断等方面也有重要参考指标[10-11]。

我国2010年自身免疫性肝病研讨会纪要对AIH诊断的结论：ANA或ASMA≥1∶40计1分，ANA或ASMA≥1：80计2分，≥6分为可能诊断为AIH，≥7分为确定诊断AIH[12]。我们的研究显示AFA-ELISA检测AIH与不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相关性，但与AFA-IFA的相关性更好(r=0.97vs0.52)。

ASMA是传统的用于AIH-Ⅰ型诊断的重要指标，ASMA可以识别包括微管、中间丝和微丝在内的多种细胞骨架成分，有文献[13]显示ASMA滴度越高，诊断AIH-Ⅰ型的敏感性越好，高滴度的ASMA对AIH-Ⅰ型诊断具有更好的灵敏度。平滑肌亚结构是微丝结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体，多聚体形成肌动蛋白丝，称为纤维状肌动蛋白(F-actin)，近年使用AFA筛查AIH-Ⅰ型得到广泛的应用[14]。AFA是AIH-Ⅰ型相关荧光模型针对的主要靶抗原，根据IFA典型的AFA荧光模型诊断AIH-Ⅰ型，可获得比ASMA更佳的特异性和敏感性[15]。Grunwald等[16]研究得出ASMA对AIH-Ⅰ型检测的敏感性为16%，而AFA对AIH-Ⅰ型诊断的灵敏度为71%。以IFA≥1∶320、ELISA≥30 U为阳性判断标准，我们的研究结果显示除AFA-ELISA与ASMA-IFA检测AIH-Ⅱ型的阳性例数比较，差异有统计学意义外，AFA-ELISA与AFA-IFA、ASMA-IFA比较，检测其他AIH各型患者例数差异均无统计学意义。

临床上最常用的IFA被认为是检测自身抗体的金标准[17]，然而AFA的操作及结果识别需要有一定经验的操作者，这可能导致AFA的检测质量下降。ELISA法由于其易实现自动化且不需要操作者的高技能水平，被越来越多地用来检测AFA。本文采用IFA和ELISA两种方法检测自身免疫疾病患者血清AFA，以IFA法作为金标准研究ELISA法检测AFA的性能，并探讨两者之间的相关性，发现AFA-ELISA检测AIH型与不同滴度的AFA-IFA、ASMA-IFA都有相关性，但与AFA-IFA的相关性更好(r=0.97vs0.52)。由于AFA-ELISA的检测方法简单易行，适合无IFA操作经验的人员开展工作，值得推广。

目前我国临床实验室检测AIH 自身抗体的质量不高，检测方法亟待规范[4-5]，从我国154家实验室检测ASMA的统计结果可知IFA法检测ASMA的阳性符合率为57.3%，阴性符合率为96.8%[18]，这个结果不是太理想，临床急需敏感性更高检测AIH-Ⅰ型的自身抗体。目前由于AIH-Ⅰ型的发病机制尚不清楚，自身抗体是病理损伤的结果还是原因尚无定论，所以自身抗体AFA检测只能作为AIH-Ⅰ型诊断的参考依据[19]。我们的研究显示AFA-ELISA 与AFA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有稍高的敏感性(76.07%vs71.17%)和略低的特异性(72.55%vs78.43%)；AFA-ELISA与ASMA-IFA相比，检测AIH-Ⅰ型有更高的敏感性和特异性(76.07%vs64.42%，72.55%vs60.78%)；AFA-ELISA 检测AIH-Ⅰ型的约登指数与AFA-IFA相近(0.49vs0.50)，比ASMA-IFA高(0.49vs0.25)，AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的ROC面积为0.86，按照ROC曲线评价标准(AUC在0.7～0.9时有较高的准确性)，AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的方法有可行性。

总之，AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型的敏感性和特异性比ASMA-IFA好，AFA-ELISA检测AIH-Ⅰ型与AFA-IFA的敏感性和特异性相近，但前者不需要操作者的高技能水平，因此，AFA-ELISA可作为AIH-Ⅰ型的较好筛查方法，值得推广应用。

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(责任编辑：王全楚)

Evaluation on anti-filamentous actin antibodies with the enzyme-linked immunosorbent assay in autoimmune hepatitis type I patients

LIU Ling1, HUANG Jie1, PENG Xiaoming1, XIAO Mingzhong2, LI Xiaodong2

1. Department of Clinical Laboratory; 2. Department of Liver Diseases, Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430061, China

Objective To evaluate anti-filamentous actin antibodies (AFA) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in autoimmune hepatitis type I (AIH-Ⅰ) patients. Methods Two hundred and fourteen consecutive untreated AIH patients (163 cases of AIH-Ⅰ, 15 cases of AIH-Ⅱ, 36 cases of AIH-Ⅲ) and 197 blood donors (controls) from Dec. 2010 to Dec. 2014 were collected. AFA was detected with ELISA, detecting AFA and anti-smooth muscle antibodies (ASMA) with indirect immunofluorescence assay (IFA) were compared. The results were statistically analyzed with SPSS 19.0. Results There was significant difference in AIH-Ⅱ patients between AFA-ELISA and ASMA-IFA (P=0.03);there was no any significant difference in other AIH patients between AFA-ELISA and AFA-IFA or ASMA-IFA (IFA≥1∶320, ELISA≥30 U). AFA-ELISA was both correlated with different titers of AFA-IFA and ASMA-IFA, but the correlation was better in AFA-IFA than ASMA-IFA for AIH-Ⅰ patients (r=0.97vs0.52). In prospective analysis, AFA-ELISA showed a similar sensitivity, specificity and Youden index but operation easier than AFA-IFA. A superior sensitivity (76.07%vs64.42%), superior specificity (72.55%vs60.78%) and superior Youden index (0.49vs0.25) compared with ASMA-IFA. The area under the curve ofROCof AFA-ELISA was 0.86, and when the concentration was 54.06 U/ml, the detection sensitivity and specificity were the best. Conclusion AFA-ELISA is a useful diagnostic method in AIH-Ⅰ patients, which is easier operated than AFA-IFA, and superior sensitivity and specificity than ASMA-IFA.

Autoimmune hepatitis; Anti-filamentous actin antibody; Anti-smooth muscle antibody; Enzyme-linked immunosorbent assay; Indirect immunofluorescence assay

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.06.016

国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题基金(JDZX2012051)

刘玲，硕士，研究方向：肝病致病机理及临床诊断学

李晓东，主任医师，教授，研究方向：肝病。E-mail: deng13098855103@163.com

R575.1

A

1006-5709(2016)06-0658-05

2015-05-17