Ca2+对洋葱内表皮细胞凋亡的影响

赵锦慧,何　乐,张　帆,郭　宁,胡利宗,王俊生

(周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001)



Ca2+对洋葱内表皮细胞凋亡的影响

赵锦慧,何乐,张帆,郭宁,胡利宗,王俊生

(周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001)

摘要：选择洋葱为实验材料，研究不同浓度的Ca2+在不同处理时间下对洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的影响．结果表明：不同浓度的Ca2+处理洋葱鳞茎内表皮1 h后就出现细胞凋亡现象，随着Ca2+浓度的升高及处理时间的延长，细胞凋亡现象更加明显，细胞凋亡率上升，细胞内丙二醛含量也上升．这表明在一定的Ca2+处理浓度与处理时间作用下，洋葱鳞茎内表皮细胞形态、细胞凋亡率及细胞内丙二醛含量均受到不同程度地影响．

关键词：钙离子；洋葱鳞茎内表皮细胞；细胞凋亡率；丙二醛含量

洋葱又叫球葱、圆葱、玉葱、葱头、荷兰葱，属于单子叶植物纲、百合目、百合科，原产亚洲西部，中国各地均有种植．洋葱是人们经常食用的一种蔬菜，它储存方便、耐运输、有特殊的香辣味，可增加食欲及预防治疗多种疾病．由于洋葱鳞茎内表皮细胞是成熟的植物细胞，具大液泡，细胞相对比较大，且相对于外表皮颜色很浅，所以可以用相应的染色剂来染色，较容易观察到细胞的各种结构，也可以得到明显的诱导效果，因此本实验选用洋葱鳞茎内表皮细胞作为实验材料．

细胞凋亡是一种生理性死亡行为，等同于细胞程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等．近年来，国内外学者不仅对细胞凋亡在生物体生长发育中的作用及体外诱导剂和逆境对细胞凋亡的影响进行了大量的研究[1-8]，而且对凋亡的分子机制及信号转导也进行了深入地探讨[9-13]．

植物的某些特定细胞除了能够在正常生长发育的特定时期发生细胞凋亡外，理化及一些生物因子等逆境胁迫也可诱导植物细胞发生类似细胞凋亡的典型形态和生化特征[14-21]．逆境胁迫诱导的植物细胞凋亡在植物界相当普遍，其中金属离子是主要的影响因素之一．当镁、锌、铜、锰、钠、铁、钙等金属离子的量比较少时，对植物的正常生长发育反而有利；当这些离子的含量比较多时，就会抑制植物的生长发育，植物体细胞也会受到损伤[6,22-27]．目前有关钙离子对洋葱内表皮细胞凋亡的影响研究未见报道，本实验设置了钙离子不同处理浓度与处理时间，通过观察在不同处理浓度与处理时间组合作用下洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的形态学表现、统计细胞凋亡率、测定丙二醛含量，探索钙离子对细胞凋亡的诱导作用，为探索植物细胞的凋亡机制提供参考．

1材料与方法

1.1实验材料

隔年洋葱，由周口师范学院生命科学与农学学院提供．

1.2试剂

PBS缓冲液、CaCl2溶液、改良苯酚品红染液、10%的三氯乙酸、0.6%的硫代巴比妥酸等．

1.3实验方法

1.3.1洋葱的复苏培养

取隔年洋葱，首先将其鳞茎外部几层干枯的表皮剥除，剪掉干枯的老根(勿伤根芽)，充分洗净后置于盛有清水的烧杯中，使根部与水接触，于25 ℃条件下培养，每天换水，并每天观察洋葱的发根情况，当露出幼嫩的白根时，表明洋葱已经复苏．

1.3.2PBS缓冲液的配制

PBS缓冲液的配制：称取一定量的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾，放入烧杯中，加适量蒸馏水，并用玻璃棒充分搅拌使其完全溶解，然后加入1 mol/L的氢氧化钠，调pH值至7.4，最后定容至1 000 mL，配制出0.2 mol/L的PBS缓冲液，保存备用．

1.3.3不同浓度Ca2+溶液的配制

分别称取一定量的氯化钙，放入4个烧杯中，分别往烧杯中加入备用的PBS缓冲液适量，并用玻璃棒充分搅拌使其完全溶解，最后定容至1 000 mL，配制成0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L的CaCl2溶液．

1.3.4改良苯酚品红染液的制备

参照卢龙斗[28]等方法制备改良苯酚品红染液．

1.3.510%三氯乙酸的配制

称取10 g三氯乙酸放入烧杯中，加蒸馏水溶解，最后定容至100 mL，配制出10%的三氯乙酸，保存备用．

1.3.60.6%硫代巴比妥酸的配制

称取0.6 g硫代巴比妥酸放入烧杯中，先加少量的1 mol/L的氢氧化钠溶解，再用10%的三氯乙酸定容至100 mL，配制出0.6%的硫代巴比妥酸，保存备用．

1.3.7实验处理设置及细胞凋亡的形态观察

取经过复苏培养的洋葱，切取0.5 cm2的内表皮若干．分别用0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L的Ca2+(CaCl2)处理内表皮1 h和8 h后，取出放于标记好的烧杯中，再经改良苯酚品红染色后，压片观察．以0 mol/L Ca2+处理为正对照，取正对照中一部分内表皮放入烧杯内，加水煮沸10 min，使细胞呈坏死态为负对照，各处理均设置3个重复．光学显微镜下比较凋亡细胞与正常细胞(正对照)、坏死细胞(负对照)在形态学上的异同，对细胞形态特征拍照，并计算细胞凋亡率．细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/视野中观察的细胞总数×100．

1.3.8丙二醛(MDA)含量的测定

参照刘萍[29]等的方法并稍作改进，测定细胞中丙二醛(MDA)含量，测定时设置3个重复，最终含量用平均值表示．具体测定方法如下：

分别称取实验各处理组洋葱鳞茎内表皮0.15 g，加2 mL 10%的三氯乙酸以及少量石英砂于研钵中充分研磨，研磨至匀浆，再用8 mL 10%的三氯乙酸进一步研磨后，定容至10 mL，匀浆以4 000 r/min离心10 min，其上清液即为MDA提取液．

取2 mL MDA提取液(正对照加2 mL PBS缓冲液)，向每个试管提取液中各加入2 mL 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，充分摇匀．置沸水浴中煮沸15 min，立即放入冷水中冷却．4 000 r/min离心10 min，取上清液，用分光光度计测其450，532，600 nm处的OD值．

MDA(μmol/gFW)=[6.45×(D532-D600)-0.56×D450]×VT/(V1×W)

1.3.9实验数据分析

采用Excel 2007作图，应用SPSS16.0统计软件分析数据，多重比较采用Duncan法．

2结果与分析

2.1对照组细胞形态结构观察

图1　对照组细胞形态结构图(10×10)

对照组细胞形态结构见图1．图1显示，正对照组细胞即正常细胞之间的界限分明，细胞轮廓清晰，细胞质透明，细胞膜完整无损，背景干净，细胞核呈球形．负对照组细胞即坏死之间的界限及细胞轮廓消失，细胞膜、细胞壁完全裂解，部分细胞核也发生裂解并且其形状和位置均发生一定变化，细胞内出现块状物质，背景不干净，细胞不能保持结构的完整．

2.2不同浓度Ca2+处理1 h后细胞凋亡观察

a.0.2 mol/L CaCl2处理1 h ; b.0.4 mol/L CaCl2处理1 h;

c.0.6 mol/L CaCl2处理1 h; d.0.8 mol/L CaCl2处理1 h

图2不同浓度Ca2+处理1 h后的细胞形态结构图(16×10)

不同浓度Ca2+处理1 h后，细胞凋亡观察结果见图2．图2显示，不同浓度Ca2+处理1 h后，细胞在形态上的表现主要为：细胞背景不干净，细胞内出现碎末状或块状物质，细胞发生质壁分离但程度不高，细胞的染色质有一定程度的边缘化，部分细胞质发生浓缩，细胞核不完整，并且出现空泡，部分细胞核紧贴细胞膜分布，形状呈不规则长条形．

2.3不同浓度Ca2+处理8 h后细胞凋亡观察

e.0.2 mol/L CaCl2处理8 h ; f.0.4 mol/L CaCl2处理8 h;

g.0.6 mol/L CaCl2处理8 h; h.0.8 mol/L CaCl2处理8 h

图3 不同浓度Ca2+处理8 h后的细胞形态结构图(16×10)

不同浓度Ca2+处理8 h后，细胞凋亡观察结果见图3．由图3可知，不同浓度Ca2+处理8 h后，细胞形态特征发生了更明显的变化．主要表现为：细胞背景极不干净，细胞内不均匀的块状物很明显，细胞质壁严重分离，部分细胞的细胞膜已经破裂，染色质有较大量的浓缩，较多细胞核边缘界限模糊，不完整，泡状结构也更明显．

2.4不同浓度Ca2+处理下洋葱内表皮细胞凋亡率统计分析

不同浓度的Ca2+处理1 h和8 h后，细胞凋亡率统计分析结果见图4．图4显示，随着Ca2+处理浓度的增加及处理时间的延长，细胞凋亡率均呈上升趋势，即Ca2+处理浓度和处理时间与细胞凋亡率均成正比．图4还显示，各处理间差异达到显著水平．这说明细胞凋亡率受Ca2+处理浓度和处理时间的双重影响，Ca2+处理时间对细胞凋亡率的影响更明显．

2.5不同浓度Ca2+处理下洋葱内表皮细胞中丙二醛(MDA)含量统计分析

不同浓度的Ca2+处理1 h和8 h后，洋葱鳞茎内表皮细胞中MDA含量及统计分析结果见图5．图5显示，Ca2+处理组丙二醛含量随着Ca2+处理时间的延长及Ca2+处理浓度的增加呈现升高趋势，正对照组细胞中MDA含量均低于Ca2+处理组，并且Ca2+处理组与正对照组之间MDA含量差异达到显著水平．Ca2+处理1 h时，MDA含量在各Ca2+处理浓度间差异不显著，Ca2+处理8 h时，高Ca2+处理浓度(0.8 mol/L)与低Ca2+处理浓度(0.2，0.4，0.6 mol/L)之间MDA含量差异显著，低Ca2+处理浓度(0.2，0.4，0.6 mol/L)之间MDA含量差异不显著．各种Ca2+处理浓度下，处理时间长(8 h)短(1 h)显著影响洋葱鳞茎内表皮细胞中MDA含量．综上所述，Ca2+处理浓度与处理时间均对洋葱鳞茎内表皮细胞中MDA含量产生影响，但Ca2+处理时间的影响程度更高．

图上不同小写字母表示差异达

A1:正对照; A2:0.2 mol/L Ca2+处理1 h; A3:0.4 mol/L Ca2+处理1 h; A4:0.6 mol/L Ca2+处理1 h; A5:0.8 mol/L Ca2+处理1 h; A6:0.2 mol/L Ca2+处理8 h; A7:0.4 mol/L Ca2+处理8 h; A8:0.6 mol/L Ca2+处理8 h; A9:0.8 mol/L Ca2+处理8 h.

图5丙二醛含量统计分析结果

3讨论

本实验结果表明：正对照组细胞形态正常，轮廓清晰，结构完整；负对照组细胞轮廓消失，不能保持细胞的完整形态；Ca2+处理组细胞出现不同程度的质壁分离，细胞轮廓发生不同程度的变化，细胞核、细胞质、细胞膜等细胞结构也发生不同程度的变化，但还能维持细胞的完整，细胞形状变小．随着Ca2+处理浓度的增加和处理时间的延长，细胞凋亡率和内表皮细胞中丙二醛含量均上升．

在动植物细胞凋亡研究中，关键就是实验材料的选择，线虫是动物细胞凋亡研究中比较合适的材料，而植物细胞凋亡研究中还未找到合适的实验材料．本研究选择隔年洋葱作为实验材料，在Ca2+作用1 h后就可以观察到细胞凋亡在形态上发生的变化，细胞凋亡率及细胞内丙二醛含量变化也比较明显，而且洋葱还具备廉价、培养方便等优点，因此选择洋葱作为植物细胞凋亡研究材料是可行的．

Ca2+之所以可以诱导细胞凋亡，可能因为Ca2+能刺激线粒体外膜上的受体，使线粒体膜通透性增高，这可以导致凋亡诱导因子及细胞色素C等促凋亡物质的释放，结果出现细胞凋亡[30]．动物细胞中很容易观察到凋亡小体，而植物细胞中很难观察到.因为动植物细胞具有明显的区别，即植物细胞具有细胞壁、液泡和叶绿体而动物细胞缺少这些结构，这些特有的结构可以在细胞凋亡中起到关键的作用[31]．本实验结果显示，洋葱内表皮细胞凋亡中并未观察到凋亡小体，这与罗琦[6]等及潘建伟[27]等研究结果相似．

在有体外诱导剂的情况下，用普通光学显微镜可以看到凋亡的细胞在早期形态和结构上发生了一定的变化，比如：细胞核染色比较深，出现固缩，有时候还会出现裂解，细胞形状变小等．当诱导剂浓度增加或者诱导时间延长时，凋亡细胞在后期会发生继发性坏死现象，坏死细胞会发生细胞膜破裂、细胞内的物质外泄、细胞崩解等现象．因此在进行细胞凋亡现象观察时，为了获得更好的实验效果，必须掌握好观察时间．本实验中，Ca2+作用8 h时，细胞凋亡现象更明显，细胞凋亡率也较高．

本实验通过光学显微镜观察到的凋亡细胞比较客观，而且实用又简便．这种方法也常用于外源药物诱导肿瘤细胞凋亡实验中或者用于肿瘤组织切片中对凋亡细胞进行计数．存在的主要缺点是凋亡细胞在早期其形态学变化还不太明显，从而造成计数误差．

本实验仅对Ca2+处理下洋葱内表皮细胞形态特征、细胞凋亡率及细胞中生理指标变化进行了分析，至于洋葱内表皮细胞发生凋亡时，有哪些因子作用，这些因子又作用到细胞的什么部位，有哪些信号分子参加并调节，信号分子的作用机制等还有待进一步研究．

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Study on apoptosis of onion induced by calcium ion

ZHAO Jinhui, HE Le, ZHANG Fan, GUO Ning, HU Lizong, WANG Junsheng

(College of Life Science and Agronomy, Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001, China)

Abstract:Utilizing onion bulb as experimental material to study the effect of different concentration of calcium ion under different processing time on apoptosis in intraepidermal cells of onion bulb. The results indicated that apoptosis generated in intraepidermal cells of onion bulb only after one hour by different concentration of calcium ion, with increased concentration and prolonged processing time of calcium ion, apoptosis phenomenon was more obvious, apoptosis rate and MDA content all went up. The above showed that under a certain concentration and processing time of calcium ion, cellular morphology and cell apoptosis rate and MDA content in intraepidermal cells of onion bulb all suffered varying degrees of effect.

Key words:calcium ion；intraepidermal cells of onion bulb；apoptosis rate；MDA content

收稿日期：2015-12-20;修回日期：2016-01-06

基金项目：国家自然科学基金项目(No.41271280)

作者简介：赵锦慧(1979- )，女，河南周口人，硕士，讲师，主要从事动植物细胞遗传分析及植物逆境生理研究工作．

中图分类号：Q942

文献标志码：A

文章编号：1671-9476(2016)02-0116-05

DOI：10.13450/j.cnki.jzknu.2016.02.029