抑郁焦虑情绪与肠道炎症潜在交互作用探讨

许笑笑，吴飞燕，费宁，连乐竞，潘建春（温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）



抑郁焦虑情绪与肠道炎症潜在交互作用探讨

许笑笑，吴飞燕，费宁，连乐竞，潘建春
（温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

［摘 要］目的：探讨抑郁焦虑情绪与肠道炎症疾病之间存在的交互作用及其可能的机制。方法：建立大鼠慢性应激模型（应激组）、肠道炎症模型（肠道炎症组）、应激加肠道炎症模型（应激+肠道炎症组），并设正常组。采用强迫游泳实验和大理石掩埋实验评估动物抑郁焦虑样行为；采用排便颗粒数及腹壁撤退反射（AWR）评估动物肠道动力情况与内脏敏感性；采用Western blot法分析大鼠脑内及肠道内蛋白表达情况。结果：应激+肠道炎症组游泳不动时间抑制率为108.4%，远大于应激组的50.2%；应激+肠道炎症组的大理石掩埋颗粒数抑制率为211.6%，远大于应激组的112.3%。应激+肠道炎症组排便颗粒数增加的抑制率为131.4%，远大于肠道炎症组的97.1%；在内脏敏感性实验中，无论在60 mmHg还是在80 mmHg时，应激+肠道炎症组的AWR抑制率均大于肠道炎症组。应激+肠道炎症组大鼠海马及额叶皮层内脑源性神经营养因子（BDNF）、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（p-CREB）表达降低较应激组更为显著；应激+肠道炎症组回肠及结肠内炎症因子IL-1β、IL-6表达升高均较肠道炎症组更为显著。结论：抑郁焦虑等情绪可通过调节肠内IL-1β及IL-6表达加重肠道功能紊乱，而肠道功能的紊乱又可通过调节脑内BDNF水平及降低环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化加重抑郁焦虑等情绪，即抑郁焦虑情绪和肠道炎症两者之间具有一定程度的交互作用。

［关键词］抑郁焦虑；肠道炎症；脑肠互动

抑郁症作为21世纪人类面对的最大疾病之一，其在全球患病率高达16.2%［1-2］。临床发现，以抑郁症就诊的患者常有不思饮食、胃肠不适、大便便溏等主诉［3］。同时，肠道功能紊乱患者也常会发生情绪低落、兴趣减退等不良精神状况［4］，如约70%以炎症性肠炎就诊的患者认为他们的精神心理因素对他们的疾病产生了影响［5-6］。基于以上发现，笔者推测焦虑等情绪因素与肠道炎症引起的消化道功能紊乱之间存在一些联系。因此，本研究采用慢性应激模型、急性肠道炎症模型，以及应激+肠道炎症模型来探讨抑郁焦虑情绪和肠道炎症间可能存在的相互作用及其机制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：雄性SD大鼠32只，二级，体质量200～220 g，购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（浙）2014-0150。随机分成4组（应激组、肠道炎症组、应激+肠道炎症组、正常组），每组8只，在21～23 ℃，40%～60%湿度，自然光照条件下饲养，自由摄食饮水。本研究经温州医科大学动物实验伦理委员会批准。

1.1.2仪器：BS 110S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；WH 966漩涡混合器（太仓市科教器材厂）；超低温保存箱（海尔公司）；64R超速冷冻离心机（美国BECK-MAN公司）；超声匀浆器（军事医学科学院实验仪器厂）；pH S-25型酸度计（上海医用核子仪器厂）；Western blot电泳槽和转膜仪（美国Bio-Rad公司）。

1.1.3试剂和药物：水合氯醛购于国药集团化学试剂有限公司；三硝基苯磺酸（5%，2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）购于美国Sigma公司；一抗脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、ECL曝光液购于美国Abcam公司；一抗环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（p-CREB）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和β-actin均购自美国Cell Signaling Technology公司，二抗购自美国Santa Cruz公司；脱脂奶粉购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；PVDF膜和30%聚丙烯酰胺购自Solarbio公司；Tris-Hcl购自中国Biosharp公司；SDS、APS、TEMED均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2实验方法 各模型建立方法如下，对照组不予特殊处理。所有模型大鼠自第22天开始进行行为学测试，每天进行一种测试，检测前禁食12～16 h，饮水自由。

1.2.1慢性不可预知应激模型［7］：应激时程共计21 d，每天给予1～2种不同的应激，包括：禁食24 h、禁水24 h、室温强迫游泳15 min、4 ℃冰水游泳5 min、40 ℃热水游泳5 min、夹尾5 min、潮湿垫料4 h、昼夜颠倒12 h、45°倾斜笼子4 h，游泳刺激时间和形式每天随机，3 d内不重复。

1.2.2急性肠道炎症模型［8］：5%水合氯醛麻醉大鼠后，于距肛门6 cm处注射5% TNBS与无水乙醇1∶1 的TNBS混合液，每只大鼠按0.015 mL·kg-1的体积注射。

1.2.3应激加肠道炎症模型：即急性肠道炎症模型联合21 d慢性应激。

1.2.4强迫游泳实验［9］：于测试前1 d，将大鼠置于盛有清水的玻璃圆缸（45 cm×35 cm×60 cm）内，训练15 min，24 h后测试。观察并记录大鼠在5 min内强迫游泳的不动时间（当大鼠停止挣扎，浮在水面保持不动或仅做一些必要的轻微动作使头部浮在水面的时间视为不动时间）。为了更直观地分析，指定强迫游泳不动时间抑制率（%）=（相应组不动时间-正常组不动时间）/正常组不动时间×100%。

1.2.5大理石掩埋实验［10］：将大鼠单独放入一个盒子（47 cm×27 cm×15 cm）中，底部的垫料上摆放9颗直径为2.3 cm的玻璃球，球布局为每排3个，共3排。给予噪音，记录噪音下大鼠10 min内掩埋的玻璃球个数。当珠子被埋入垫料一半或者一半以上视为掩埋。大理石掩埋颗粒数抑制率（%）=（相应组掩埋颗粒数-正常组掩埋颗粒数）/正常组掩埋颗粒数×100%。

1.2.6肠道动力测定［11］：用束缚器束缚正常摄食饮水的大鼠，并记录1 h内大鼠束缚时的排便颗粒数。排便颗粒数抑制率（%）=（相应组排便颗粒数-正常组排便颗粒数）/正常组排便颗粒数×100%。

1.2.7内脏敏感性实验［12］：将橡胶手指套制成5 cm长的球囊塞入乙醚麻醉的大鼠肛门6 cm，该球囊通过注射器注气增加球囊压力，同时通过血压计对压力进行控制。待大鼠适应30 min清醒后，依次按照20、40、60、80 mmHg等压力级别注入空气，每等级持续5 min，观察5次，并记录大鼠腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分。具体评分标准如表1。而各组内脏敏感性抑制率（%）=（相应组AWR评分-正常组AWR评分）/正常组AWR评分×100%。

表1　大鼠AWR评分表

1.2.8Western blot法检测：行为学实验结束后用10%水合氯醛麻醉大鼠，断头杀鼠，取脑组织，在冰上分离额叶皮层和海马，剖腹取回肠和结肠，用锋利的刀片刮取肠黏膜组织。分装在各EP管中，每个EP管的样本加300 μL的含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的细胞裂解液，匀浆后低温高速离心2次（4 ℃，12 000 r·min-1，20 min）。取上清液，BCA法进行蛋白测定。各组蛋白取60 μg样品，沸水浴5 min使蛋白变性，冷却后上样。用15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳先80 V恒压浓缩，再120 V恒压分离，湿法转膜法300 mA转膜1 h，随后0.5%脱脂牛奶封闭2 h，以0.1%吐温20 Tris缓冲液（TBST）洗涤3次，用0.05%的TBST稀释的一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，同浓度的TBST洗膜3次后，辣根过氧化物酶偶联的IgG（1∶1 000）二抗孵育1 h，TBST洗涤3次。条带用ECL试剂盒曝光后用Quantity one软件分析。在进行BDNF及p-CREB含量表达分析时，指定蛋白抑制率（%）=（正常组该蛋白表达量-相应组的指定蛋白表达量）/正常组该蛋白表达量×100%。在IL-1β及IL-6含量表达分析时，指定蛋白抑制率（%）=（相应组的指定蛋白表达量-正常组该蛋白表达量）/正常组该蛋白表达量×100%。

1.3统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，数据以±s表示，用单因素方差分析中的Dunnett t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肠道炎症对慢性应激的影响

2.1.1强迫游泳实验结果：与正常组相比，应激组大鼠游泳的不动时间明显增加（P＜0.05），而应激+肠道炎症组不动时间较应激组更长，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。应激组的强迫游泳不动时间抑制率为50.2%，肠道炎症组为28.0%，应激+肠道炎症组为108.4%。

2.1.2大理石掩埋实验结果：应激组大鼠掩埋颗粒数较正常组明显增加（P＜0.05）；应激+肠道炎症组大鼠掩埋颗粒数较应激组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；肠道炎症组与正常组比较，其大理石掩埋颗粒数有增加趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。应激组的大理石掩埋颗粒数抑制率为112.3%，肠道炎症组为70.5%，应激+肠道炎症组为211.6%。

图1　各组强迫游泳不动时间比较

图2　各组大理石掩埋颗粒数比较

2.1.3脑内BDNF表达情况：与正常组相比，应激组大鼠海马及额叶皮层中BDNF的表达明显降低（P＜0.05）；应激+肠道炎症组此2脑区中BDNF水平较应激组降低更加显著，差异有统计学意义（P＜0.05）；肠道炎症组与正常组比较，大鼠海马及额叶皮层中BDNF的表达均有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。海马中，应激组BDNF抑制率为24.0%，肠道炎症组为15.6%，应激+肠道炎症组为45.8%；而在额叶中，应激组BDNF的抑制率为33.0%，肠道炎症组为10.4%，应激+肠道炎症组为45.5%。

2.1.4脑内p-CREB表达情况∶应激组海马与额叶皮层中p-CREB的表达较正常组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；应激+肠道炎症组海马中p-CREB水平较肠道炎症组或应激组降低更加显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）；肠道炎症组p-CREB的表达有下降趋势，但与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。在海马中，应激组的p-CREB表达抑制率为22.8%，肠道炎症组为18.3%，应激+肠道炎症组为46.2%；额叶中，应激组的p-CREB抑制率为32.2%，肠道炎症组为10.5%，应激+肠道炎症组为52.8%。

2.2慢性应激对肠道炎症的影响

2.2.1肠道动力测定结果：与正常组相比，肠道炎症组大鼠排便颗粒数明显增加（P＜0.05）；应激+肠道炎症组排便颗粒数增加更明显，但与肠道炎症组比差异无统计学意义（P＞0.05）；应激组排便颗粒数有增加的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。应激组大鼠排便颗粒数抑制率为45.7%，肠道炎症组为97.1%，应激+肠道炎症组为131.4%。异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。而无论在多大的压力下，应激组大鼠内脏敏感性较正常组有所增加，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图6。在60 mmHg压力时，应激组的AWR抑制率为22.2%，

图3　脑内BDNF表达情况

图4　脑内p-CREB表达情况

图5　各组排便颗粒数比较

图6　各组AWR评分比较

2.2.2内脏敏感性实验结果：肠道炎症组大鼠在压力为40、60和80 mmHg扩张直肠时的AWR评分显著高于正常组（P＜0.05），且评分随着压力的增加而有一定的上升。在60和80 mmHg压力时，应激+肠道炎症组AWR评分明显高于肠道炎症组大鼠，差肠道炎症组为66.7%，应激+肠道炎症组为109.5%。在80 mmHg压力时，应激组的AWR抑制率为33.3%，肠道炎症组为100.0%，应激+肠道炎症组为147.6%。2.2.3 肠内IL-1β表达情况：与正常组相比，肠道炎症组大鼠回肠及结肠中IL-1β的表达水平明显升高（P＜0.05），应激+肠道炎症组IL-1β表达量较肠道炎症组升高更加显著，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。应激组大鼠蛋白表达与正常组相比均有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。回肠中，应激组的IL-1β表达抑制率为42.3%，肠道炎症组为54.0%，应激+肠道炎症组为109.7%；结肠中，应激组的IL-1β抑制率为25.5%，肠道炎症组为50.2%，应激+肠道炎症组为95.4%。

2.2.4肠内IL-6表达情况：与正常组相比，肠道炎症组大鼠回肠及结肠内IL-6的表达明显升高（P＜0.05），应激+肠道炎症组表达量较肠道炎症组升高更加明显，其中回肠中差异具有统计学意义（P＜0.05）。应激组大鼠蛋白表达与正常组相比有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图8。回肠中，应激组IL-6表达的抑制率为35.7%，肠道炎症组为54.0%，应激+肠道炎症组为114.7%。结肠中，应激组的IL-6表达抑制率为12.7%，肠道炎症组为35.3%，应激+肠道炎症组为56.0%。

图7　肠内IL-1β表达情况

图8　肠内IL-6表达情况

3　讨论

近年来，关于脑肠相互作用的研究［13］越来越多。神经胃肠病学的研究表明，自主神经-肠神经系统是分布在胃肠道中的巨大网络［14-15］，其可能含有大脑中枢神经系统与胃肠道互动的传入传出神经纤维，可通过各种神经递质（如脑肠肽［16］）释放、传递，将胃肠道与中枢神经系统联系起来。而该类神经递质多达60多种［17］，其中囊括了本实验所检测的BDNF及CREB等。BDNF和CREB广泛存在于海马及额叶皮层中。据文献报道，慢性应激后，大鼠海马和额叶内的BDNF与p-CREB的表达下降［18-20］，而此两者含量的下降可引起抑郁症状的发生［21-23］。

慢性应激模型可模拟环境诱因，引发动物出现与抑郁症相似的行为及生理学改变，是近年来应用最广泛的抑郁动物模型之一。强迫游泳实验中的不动时间通常被用来衡量动物在水中的绝望感，即动物的抑郁情绪。而大理石掩埋的颗粒数通常被用来衡量动物的焦虑情绪。本研究中，肠道炎症模型是利用了TNBS/乙醇法给予动物灌肠，从而使得肠黏膜屏障被破坏，TNBS与肠组织蛋白结合形成抗原，进而引发急性肠炎。

本研究结果显示，应激组大鼠无论在强迫游泳实验中还是在大理石掩埋实验中都表现出抑郁焦虑样行为，而单纯肠道炎症大鼠并未表现出显著的抑郁焦虑倾向，在慢性应激的基础上再给予肠道炎症刺激，大鼠的抑郁样行为较单纯应激大鼠更加严重。本研究Western blot检测结果显示，应激后大鼠海马及额叶内BDNF表达、CREB磷酸化水平均显著下降，这与之前的报道［18-20］一致。在慢性应激的基础上，联合肠道炎症使得大鼠海马内BDNF表达水平及CREB磷酸化水平较单纯应激组下降更加显著，且慢性应激+肠道炎症大鼠的抑郁样表现程度比单纯应激与单纯肠炎抑制率叠加更为严重。表明肠道炎症通过改变大脑神经递质BDNF及p-CREB的表达加重了抑郁焦虑的倾向，且该加重效果并非只是2种刺激作用的效果叠加，而是通过中枢神经-肠神经系统［14-15］改变了脑肠肽的分泌释放，从而加重了情绪障碍。

本实验中TNBS/乙醇法进行肠道炎症的造模后，肠道炎症组大鼠无论从肠道动力学测试还是内脏敏感性测试结果来看，其肠道功能都发生了一定的紊乱。单纯的应激小鼠其肠道功能较正常小鼠有些许失常，但差异无统计学意义。而在肠道炎症的基础上再给予慢性应激后，肠道紊乱情况更加严重，提示，长期慢性应激可加重肠道炎症症状。Western blot检测结果显示，肠道炎症大鼠的回肠、结肠内炎症因子IL-1β、IL-6水平显著升高，而单纯应激大鼠肠内炎症介质表达变化并不显著，但在肠道炎症基础上再给予慢性应激，则炎症因子IL-1β、IL-6水平较单纯肠道炎症大鼠显著增高，且其肠炎加重情况也大于2种刺激效果的单纯叠加，进一步验证了慢性应激可能通过中枢神经-肠神经系统加重肠道炎症反应。

综上所述，无论是TNBS乙醇法引起的肠道炎症加重动物本身的抑郁焦虑倾向，还是应激导致的情绪障碍加重动物的肠道功能紊乱情况，这些现象都说明了机体内的中枢系统和肠神经系统之间存在双向交通通路，即当机体肠道内发生一定的刺激后，肠神经系统将接受该种刺激信号并通过肠神经系统与高级神经中枢网络来影响机体的抑郁焦虑情绪及脑内的相关蛋白分泌。相同地，当机体受到应激后也可通过该网络反作用于肠神经系统来影响动物的肠感觉、动力及肠道内因子的表达。即中枢系统与肠道神经系统具有双向调节作用。

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（本文编辑：丁敏娇）

Study on interaction of depression，anxiety and intestinal inflammation

XU Xiaoxiao，WU Feiyan，FEI Ning，LIAN Lejing，PAN Jianchun. College of Pharmacy，Wenzhou Medical University，Wenzhou，325035

Abstract:Objective: To investigate the interaction and the potential mechanism of stress and intestinal inflammation. Methods: Stress model was established by eight different stress factors within 21 days，The intestinal inflammation group was established by anal enema （TNBS），stress combined with intestinal inflammation model were established by the combination of two models above. From 22 days，all rats were given behavioral tests，including forced swimming test （FST），the marble burying test，the number of fecal output and AWR test，then rats were sacrificed. The expressions of BDNF and phosphorylated cAMP in the hippocampus and frontal cortex，IL-1β，IL-6 in the ileum and colon were detected by Western Blotting. Results: The freezing time of stressed combined with intestinal infection group was significantly lower in FST，the number of marbles buried in marble burying test was also significantly lower，the number of fecal output and the score of AWR were obviously reduced when compared with merely chronic stress group or merely intestinal inflammation group. The expression of BDNF and p-CREB were reduced more significantly whether in the hippocampus or frontal cortex. The expression of IL-1β and IL-6 increased more significantly whether in the ileum or colon when compared with merely chronic stress group or merely intestinal inflammation group. Conclusion: Depression or anxiety as psychological factors，has certain interaction with intestinal inflammation. depression and anxiety emotions can increase the intestinal disorders，and the intestinal disorders can exacerbate depression or anxiety emotions also. The mechanism may be involved with enteric nervous system and central nervous system，the two system play the role by regulate the braingut peptide.

Key words:depression and anxiety； intestinal inflammation； braingut interaction

通信作者：潘建春，教授，硕士生导师，Email：wenzhoupan2003@ 163.com。

作者简介：许笑笑（1990-），女，浙江台州人，硕士生。

收稿日期：2015-08-03

［中图分类号］R964

［文献标志码］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.008