还原型谷胱甘肽对哮喘豚鼠气道上皮细胞的保护作用

张筠　张铁栓　韩利

(郑州大学第二附属医院 呼吸内科　河南 郑州　450014)



还原型谷胱甘肽对哮喘豚鼠气道上皮细胞的保护作用

张筠张铁栓韩利

(郑州大学第二附属医院 呼吸内科河南 郑州450014)

【摘要】目的探索还原型谷胱甘肽对哮喘豚鼠气道上皮细胞凋亡的保护作用。方法将40只豚鼠随机分为正常对照组、哮喘组、还原型谷胱甘肽组和地塞米松组，每组10只，应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液中的干扰素-r(INF-r)水平及肺组织总抗氧化能力(T-AOC)，原位末端转移酶标记染色法(TUNEL染色)检测气道上皮细胞凋亡情况，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织B淋巴细胞/白血病-2信使核糖核酸(Bcl-2 mRNA)的表达。结果与哮喘组相比，还原型谷胱甘肽组支气管肺泡灌洗液中干扰素-r(INF-r)显著升高(P<0.05)，与地塞米松组相似(P>0.05)，气道上皮细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)显著降低(P<0.05)，肺组织T-AOC测定及Bcl-2 mRNA的表达均显著升高(P<0.05)。结论还原型谷胱甘肽对哮喘豚鼠气道上皮细胞凋亡具有保护作用。

【关键词】哮喘；还原型谷胱甘肽；凋亡

支气管哮喘是较为常见的呼吸系统疾病之一，发病率近年有上升趋势，不仅对个人身体造成严重影响，也为社会增加负担。因其本质是气道慢性炎症，Que等[1]通过对哮喘患者行肺部活检发现其呼吸道上皮细胞凋亡增加，同时，体外实验也证明，在强氧化剂的作用下哮喘患者的呼吸道上皮细胞更容易发生凋亡。还原型谷胱甘肽作为一种重要的在细胞内外均有保护作用的抗氧化剂，本文研究其对哮喘的气道上皮细胞凋亡是否具有保护作用，可为临床治疗提供新的方向。

1材料与方法

1.1实验动物健康豚鼠40只，雌雄各20只，购于郑州大学医学院实验动物中心，体质量(450±25)g，于清洁通风环境中分笼喂养。将40只豚鼠随机分为正常对照组、哮喘组、地塞米松组和还原型谷胱甘肽组，每组10只。

1.2主要试剂与仪器鸡卵白蛋白(美国Sigma公司)，还原型谷胱甘肽(阿拓莫兰)注射液(重庆药友制药责任有限公司)，原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)(德国Boehringer Mannheim公司)，图像记录分析系统(D-14)(大连竞迈生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1动物模型准备采用鸡卵白蛋白致敏和激发建立豚鼠哮喘模型，第1天腹腔内注射2%鸡卵白蛋白氢氧化铝凝胶2 ml致敏豚鼠，第8天重复注射加强致敏，第21天吸入2%鸡卵白蛋白生理盐水激发哮喘发作，雾化吸入10 min前腹腔注射生理盐水2 ml，共7 d，以豚鼠腹肌出现明显收缩、呛水、喘鸣等呼吸道阻塞症状为造模成功[2]。

1.3.2干预正常对照组：第1天腹腔内注射生理盐水2 ml，第8天重复注射，第21天吸入生理盐水10 ml/10 min，雾化吸入10 min前腹腔注射生理盐水2 ml，共7 d。地塞米松组：诱发前给予2 ml地塞米松2 mg/(kg·d)剂量配比液腹腔注射，共7 d。还原型谷胱甘肽组：诱发前给予2 ml还原型谷胱甘肽0.1 g/(kg·d)剂量配比液腹腔注射，共7 d。

1.3.3标本留取与检测全部豚鼠于末次激发后24 h，腹腔注射10%乌拉坦1.5 ml麻醉，以开胸后心脏采血的方法处死，用聚乙烯导管插入右肺总支气管，37.0 ℃生理盐水3 ml/次缓慢灌洗右肺，反复3次，收集回收液离心，取上清液进行ELISA法测定INF-r，再沿左支气管走形方向取肺组织，分4等份，分别采用ELISA法测定T-AOC，行TUNEL染色计算细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)，做电镜切片及RT-PCR技术检测Bcl-2 mRNA。

1.4统计学处理应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1动物性状变化正常对照组豚鼠肥大强壮，精神良好，饮食正常，活泼爱动，口唇红润，皮毛有光泽且不易脱落。哮喘组豚鼠发育不良，精神萎靡，饮食及活动量少，口唇发绀，皮毛枯槁且有脱毛。还原型谷胱甘肽组和地塞米松组性状较哮喘组轻，虽存在一定程度的精神萎靡，饮食及活动量少，但无口唇发绀及脱毛现象。

2.2支气管肺泡灌洗液INF-r检查结果正常对照组INF-r明显高于哮喘组、还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，哮喘组INF-r明显低于还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，而还原型谷胱甘肽组及地塞米松组INF-r差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　支气管肺泡灌洗液INF-r检测结果

注：与正常对照组比较，aP<0.001；与哮喘组比较，bP<0.001；与还原型谷胱甘肽组比较，cP>0.05。

2.3肺组织T-AOC的测定正常对照组T-AOC高于哮喘组、还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，哮喘组T-AOC明显低于还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，还原型谷胱甘肽组T-AOC高于地塞米松组(P<0.05)。见表2。

2.4气道上皮细胞凋亡的检测通过TUNEL染色对气道上皮凋亡的检测中发现，各组豚鼠气道上皮细胞均存在不同程度的凋亡现象。正常对照组气道上皮凋亡明显低于哮喘组、还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，哮喘组气道上皮凋亡明显高于还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，而气道上皮凋亡在还原型谷胱甘肽组及地塞米松组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3及图1。

表2　各组豚鼠肺组织T-AOC比较

注：与正常对照组比较，dP<0.001；与哮喘组比较，eP<0.001；与还原型谷胱甘肽组比较，fP<0.001。

表3　各组豚鼠气道上皮凋亡指数比较±s)

注：与正常对照组比较，gP<0.001；与哮喘组比较，hP<0.001；与还原型谷胱甘肽组比较，iP>0.05。

A为正常对照组；B为哮喘组；C为地塞米松组；D为还原型谷胱甘肽组。

图1各组气道上皮细胞凋亡图

2.5电镜结果正常对照组气道上皮细胞结构基本正常，仅有少部分细胞肿胀，细胞器完整。哮喘组支气管上皮细胞重度肿胀，细胞膜消失，细胞质内容溢出，细胞结构消失。地塞米松组支气管上皮细胞单层排列，部分细胞明显肿胀，细胞质内线粒体嵴溶解、消失，空泡样改变。还原型谷胱甘肽组支气管上皮细胞单层排列，部分细胞肿胀，细胞质内线粒体丰富，部分线粒体呈肿胀状态，另可见少量的粗面内质网、核糖体、高尔基复合体及溶酶体等细胞器。见图2。

E为正常对照组；F为哮喘组；G为地塞米松组；H为还原型谷胱甘肽组。

图2各组支气管上皮细胞电镜图

2.6各组豚鼠肺组织Bcl-2mRNA的表达正常对照组Bcl-2 mRNA的表达高于哮喘组、还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，哮喘组Bcl-2 mRNA的表达明显低于还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，还原型谷胱甘肽组Bcl-2 mRNA的表达高于地塞米松组(P<0.05)。见表4和图3。

表4　各组豚鼠肺组织Bcl-2 mRNA的表达

注：与正常对照组比较，jP<0.001；与哮喘组比较，kP<0.001；与还原型谷胱甘肽组比较，lP<0.001。

图3　各组豚鼠肺组织Bcl-2 mRNA的表达情况

3讨论

有研究显示哮喘炎症反应使氧自由基产生增加，导致氧化应激，肺组织抗氧化能力下降，支气管上皮凋亡增加，气道上皮损伤[3-4]。那么，维持氧化-抗氧化平衡可能成为治疗哮喘的新出发点[5]。还原型谷胱甘肽是一个在哺乳动物细胞中普遍存在的包括巯基的三肽(左旋谷氨酰半胱氨酸-甘氨酸)。它是一个重要的有保护作用、抗自由基和其它氧化剂作用的抗氧化剂，而且它还涉及免疫调节和炎症反应[6]。抗氧化剂还原型谷胱甘肽具有重要的肺抗氧化剂防御功能，尤其在保护上皮(基膜完整性)不受氧化/自由基(香烟/空气微粒)介导的损伤和炎症，它在保持气道上皮细胞完整性，抵御肺部损伤与炎症等方面起重要作用[7-8]。

正常情况下呼吸道上皮细胞数目保持相对稳定，呼吸道上皮可发生较低水平的增殖，同时存在相应的自发性凋亡，两者受到凋亡-抗凋亡和增殖-抗增殖的精密调节，呼吸道上皮凋亡是哮喘的重要病理特征，也是哮喘不同于其他慢性呼吸道疾病呼吸道重塑的重要特征[9]。糖皮质激素虽被证实在大多数情况下能很好地控制气道炎症，但对呼吸道重塑特别是呼吸道上皮细胞凋亡的作用仍存争议[10]。细胞凋亡由多种基因控制，参与细胞凋亡的相关基因多达数十种，根据功能不同大致可分为3类。凋亡促进基因：P53、WAF1、myc、Fas/FAS配体等；凋亡抑制基因：Bcl-2、IAP、Bak、EIB、Bax；双向调节基因：C-myc、Bcl-X等。其中Bcl-2的研究最为详细。Bcl-2是B淋巴细胞/白血病-2(B cell lympona/leukemia-2)基因的缩写形式，它是第1个被确认具有抑制凋亡作用的基因，主要分布在线粒体内膜、细胞内膜表面、内质网、核膜等处，广泛存在于上皮细胞、造血细胞、神经细胞、淋巴细胞及多种瘤细胞。目前认为，Bcl-2主要通过以下机制抗凋亡[11-12]：直接抗氧化；抑制线粒体释放促凋亡蛋白质；抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶的激活；维持细胞钙稳态。本研究通过以下几方面证实了还原型谷胱甘肽对哮喘豚鼠气道上皮细胞凋亡具有保护作用：一般性状变化较轻；支气管肺泡灌洗液中INF-r显著升高；电镜结果显示支气管上皮细胞、细胞器病理改变较轻；气道上皮细胞凋亡程度较轻；Bcl-2 mRNA表达上调。这提示还原型谷胱甘肽可能通过清除氧自由基的功能影响细胞内信号转导，从而影响调节细胞凋亡的某些基因或者蛋白的表达，如还原型谷胱甘肽上调了Bcl-2 mRNA的表达，从而抑制气道上皮细胞的凋亡。

哮喘研究中对Th1/Th2细胞失衡机制关注较多。作为Th1的代表因子，INF-r是评估哮喘病情的重要指标。糖皮质激素作为哮喘治疗的一线用药，其可通过提高INF-r改善Th1/Th2细胞失衡状态，本研究结果与之相符合，但长期应用糖皮质激素，相关副作用也逐渐被广泛关注。哮喘组INF-r明显低于还原型谷胱甘肽组及地塞米松组(P<0.05)，而还原型谷胱甘肽组及地塞米松组INF-r差异无统计学意义(P>0.05)，提示还原型谷胱甘肽与糖皮质激素在调节Th1/Th2细胞失衡机制中有着相似的作用。本项研究为哮喘的治疗带来了新的思路，但其能否在临床推广，尚需进一步研究。

参考文献

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Protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma

Zhang Yun，Zhang Tieshuan，Han Li

(DepartmentofRespiratoryMedicine，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma. MethodsForty guinea pigs were randomly divided into 4 groups: control group, asthma group, reducing glutathione group and dexamethasone group, 10 guinea pigs in each group. INF-r level in bronchoalveolar lavage fluid was detected by enzyme linked immunosorbent assay. TUNEL was used to detect the level of epithelial cells and RT-PCR was used to determine the status of Bcl-2mRNA in lung tissue. ResultsCompared with asthma group, the INF-r levels in bronchoalveolar lavage fluid of reducing glutathione group were statistically higher(P<0.05), similar with that in the dexamethasone group(P>0.05).The levels of T-AOC and Bcl-2 mRNA in lung tissue of reducing glutathione group were significantly upper compared with asthma group(P<0.05). ConclusionReducing glutathione have the ability to protect airway epithelium in guinea pig models of asthma.

【Key words】asthma；reducing glutathione；apoptosis

(收稿日期：2015-09-25)

【中图分类号】R 392.3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.04.005

通讯作者：张铁栓，E-mail：huxizhangtieshuan@163.com。