阿托伐他汀对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子和血管内皮的影响

张艳丽，陈还珍，刘　帅，刘子源，魏　霞

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西医科大学第一医院



阿托伐他汀对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子和血管内皮的影响

张艳丽1，陈还珍2，刘帅1，刘子源1，魏霞1

1.山西医科大学第一临床医学院(太原 030001)；2.山西医科大学第一医院

摘要：目的观察阿托伐他汀对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子表达水平的影响。方法 将27只清洁级C57BL/6小鼠随机分成3组，模型组和干预组饮用2%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液，干预组在造模前1周给予阿托伐他汀灌胃，持续42 d至实验结束。比较各组小鼠的一般情况和结肠组织病理学，ELISA法检测血清白介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)的水平，免疫组化法检测主动脉核转录因子(NF-κB)和VEGF的表达。 结果与对照组相比，模型组小鼠肠道黏膜的炎症表现明显，血清IL-8和VEGF的水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，干预组血清IL-8和VEGF的水平显著降低(P<0.05)，免疫组化法提示小鼠主动脉NF-κB和VEGF的表达减少(P<0.05)。 结论 阿托伐他汀可能通过降低炎症因子的表达水平而发挥血管内皮的保护作用。

关键词：溃疡性结肠炎；阿托伐他汀；白介素-8；血管内皮生长因子；核转录因子

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是以肠道炎症为主要表现的慢性复发性自身免疫性疾病，属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的范畴，引起肠道炎症持续存在的重要原因和特征是黏膜组织中炎细胞聚集和释放各种炎症因子。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是血管壁的慢性炎性疾病，机体慢性持续性炎症状态与动脉粥样硬化的形成密切相关。研究发现炎症性肠病病人患动脉粥样硬化的风险增加[1]，并提出持久的或活动的IBD可能是早期动脉粥样硬化的危险因素。阿托伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，除了调脂和稳定斑块的作用，还有抗炎、抗氧化及免疫调节等作用[2-3]。本研究通过观察阿托伐他汀对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子表达水平的影响，探讨其是否通过降低炎症因子的表达水平而发挥保护血管内皮的作用。

1材料与方法

1.1动物8周龄，体重20 g±2 g，清洁级C57BL/6小鼠27只，雄性，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.2主要试剂葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)分子量36 000～50 000，购自MP Biomedicals；白介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒购自Bio-Swamp Life Science；核转录因子(NF-κB)-p65多克隆抗体和VEGF-A多克隆抗体购自Bioworld Technology；免疫组化Ⅱ抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1溃疡性结肠炎小鼠模型的建立及分组27只雄性清洁级C57BL/6小鼠普通饲养1周后，随机分成3组，每组9只。对照组：正常饮用灭菌蒸馏水。模型组：自由饮用2%DSS溶液1周，停止饮用DSS溶液改用灭菌蒸馏水1周，如此循环2.5次，并给予等体积生理盐水灌胃。干预组：建模的小鼠提前1周给予阿托伐他汀混悬液10 mg/(kg·d)灌胃，每天1次，持续42 d至实验结束。实验过程中，每3 d称重1次，观察记录小鼠血便、稀便、腹泻等肠炎表现。

1.3.2取材给予腹腔注射水合氯醛麻醉后眼眶采血，采血结束后用脱颈法处死小鼠，游离主动脉、结肠和直肠，切取主动脉和肛门至回盲部的整个结直肠段，用生理盐水将主动脉和肠管冲洗干净并将标本分为几段，一部分迅速放入10%中性甲醛中，用于HE染色和免疫组化染色；另一部分迅速置于液氮中，过夜后于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3HE染色将标本置于甲醛中固定24 h～48 h，经石蜡包埋、切片、常规脱蜡、HE染色及脱水封片后，比较小鼠肠管病理学改变。

1.3.4ELISA法测定血清IL-8和VEGF将血液置于肝素化的EP 管中，静置后离心(3 500 r/min、10 min)，取血清于-20 ℃冰箱保存，实验结束后，按照试剂盒说明书测定IL-8和VEGF浓度。

1.3.5免疫组化法检测主动脉NF-κB和VEGF标本经甲醛固定、石蜡包埋及切片等，免疫组化操作过程采用SABC法，加入1抗(兔抗鼠NF-κB浓度1∶200、兔抗鼠VEGF浓度1∶200) 和生物素化山羊抗兔IgG，经DAB显色、苏木素复染等，在显微镜下获取图片并分析数据。

2结果

2.1一般情况整个实验期间，对照组小鼠反应灵敏、毛色有光泽，粪便呈暗褐色、质地较硬，体重均有不同程度的增加；模型组小鼠反应迟缓、倦怠懒动、食欲减退，稀便或血便，体重均有不同程度的下降，阿托伐他汀干预后小鼠上述表现明显好转。

2.2结肠组织病理损害镜下可见对照组小鼠结肠组织结构完整，黏膜无充血、水肿及炎细胞浸润；模型组小鼠结肠组织炎症明显，黏膜充血水肿、糜烂，甚至典型溃疡形成，伴炎细胞浸润，腺体排列紊乱甚至消失；干预组肠道炎症较模型组明显减轻，黏膜和腺体逐渐被修复，黏膜充血水肿、糜烂好转。详见图1。

对照组模型组干预组

图1各组小鼠结肠组织HE染色结果(×40 倍)

2.3血清IL-8和VEGF的水平比较与对照组相比，模型组小鼠血清IL-8和VEGF的水平显著升高；与模型组相比，干预组血清IL-8和VEGF的水平显著降低。3组间血清IL-8和VEGF比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1　各组血清IL-8、VEGF水平比较(±s) 　pg/mL

2.4主动脉NF-κB和VEGF的水平比较与对照组相比，模型组和干预组小鼠主动脉NF-κB和VEGF表达增加(P<0.05)，主要见于血管内皮细胞(镜下可见活化的NF-κB主要位于细胞核；VEGF染色主要位于细胞质)，呈棕褐色；与模型组相比，干预组小鼠主动脉NF-κB和VEGF表达减少(P<0.05)。详见表2。

表2　各组主动脉NF-κB、VEGF OD值比较(±s)

3讨论

溃疡性结肠炎的病因和发病机制尚未明确，研究发现，细胞因子在UC肠黏膜免疫反应中发挥着重要作用。Ross于1999年在损伤反应学说的基础上，提出动脉粥样硬化是一种炎性疾病，具有慢性炎症特征的病理过程，其发生发展始终伴随着炎症反应。研究评估了IBD病人动脉粥样硬化的预测因素，发现IBD存在早期动脉粥样硬化[4]。研究认为IL-8在UC发病过程中不可缺少，能激活并趋化中性粒细胞，释放一系列活性产物，引起机体局部炎症反应。溃疡性结肠炎病人肠黏膜高表达NF-κB-p65，且IL-8表达水平升高与NF-κB呈正相关[5]。他汀类除了调脂和稳定斑块的作用，还有抗炎、抗氧化及免疫调节等作用。本实验发现，模型组小鼠血清IL-8水平显著升高，阿托伐他汀干预后结肠炎症明显减轻，血清IL-8显著降低，表明阿托伐他汀可降低UC小鼠炎症因子的表达。

NF-κB信号通路是主要的炎症通路之一，其异常激活与AS的发生发展密切相关[6]。研究显示活化的NF-κB存在于人类动脉粥样硬化斑块上。AS小鼠主动脉NF-κB mRNA表达显著增加，抗AS药物可降低NF-κB表达[7]。本实验中模型组小鼠主动脉NF-κB表达增加，阿托伐他汀干预后小鼠NF-κB表达减少，与上述研究结果一致。

VEGF可通过炎症浸润和新生血管形成等机制促进AS的形成[8]。正常生理条件下，VEGF呈低表达或不表达，但氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、炎症因子等动脉粥样硬化危险因素可促进VEGF的表达，研究表明，人冠状动脉粥样斑块标本中VEGF高度表达，急性冠脉综合征病人血清VEGF水平也显著升高[9]。Wilson等[10]证实，他汀类可减少VEGF的表达，减少新生血管形成。本实验发现，模型组小鼠血清和主动脉VEGF的水平显著升高，阿托伐他汀干预后小鼠血清和主动脉VEGF表达降低。

他汀可抑制NF-κB的转录活性和DNA结合活性，通过抑制基因的表达和NF-κB的信号传导而具有免疫调节和抗炎的作用[11]。他汀类药物的抗炎机制可能与降低炎症因子的表达、减少炎细胞的黏附和聚集、抑制平滑肌细胞的增生和迁移有关。本实验发现，模型组小鼠炎症因子表达水平升高，阿托伐他汀干预后血清IL-8水平显著下降，且干预组小鼠主动脉NF-κB和VEGF表达降低，表明阿托伐他汀可能通过抑制NF-κB转录活性，降低炎症因子的水平，进而干预炎症反应，减少VEGF的表达而发挥血管内皮的保护作用。阿托伐他汀因其多效性可能具有潜在的控制溃疡性结肠炎和防治冠状动脉疾病的双重作用，关于溃疡性结肠炎早期动脉粥样硬化的发病机制及有效的防治策略需要更多大型的临床研究和动物实验加以证实。

参考文献：

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[3]Abe Y，Murano M，Murano N，et al.Simvastatin attenuates intestinal fibrosis independent of the anti-inflammatory effect by promoting fibroblast/myofibroblast apoptosis in the regeneration/healing process from TNBS-induced colitis[J].Dig Dis Sci，2012，57(2)：335-344.

[4]Dagli N，Poyrazoglu OK，Dagli AF，et al.Is inflammatory bowel disease a risk factor for early atherosclerosis?[J].Angiology，2010，61(2)：198-204.

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[8]Celletti FL，Waugh JM，Amabile PG，et al.Vascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plaque progression[J].Nat Med，2001，7(4)：425-429.

[9]王春彬，高大中．高脂血症兔主动脉NF-κB、VCAM-1和VEGF的表达及氟伐他汀的影响[J]．中国心血管病研究，2008，6(5)：379-382．

[10]Wilson SH，Herrmann J，Lerman LO，et al.Simvastatin preserves the structure of coronary adventitial vasa vasorum in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering[J].Circulation，2002，105(4)：415-418.

[11]Zhu T，Wang DX，Zhang W，et al.Andrographolide protects against LPS-induced acute Lung injury by inactivation of NF-κB[J].PLoS One，2013，8(2)：e56407.

(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2015-10-25)

中图分类号：R573.1R259

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．012

文章编号：1672-1349(2016)06-0597-03

通讯作者：陈还珍，E-mail：276085726@qq.com