乌司他丁注射液对急性肺损伤循环内皮祖细胞血管生成能力的影响

罗帮镇，谢南姿，刘　阳，王海峰，谢晓云

同济大学附属同济医院(上海 200065)



乌司他丁注射液对急性肺损伤循环内皮祖细胞血管生成能力的影响

罗帮镇，谢南姿，刘阳，王海峰，谢晓云

同济大学附属同济医院(上海 200065)

摘要：目的观察乌司他丁注射液对急性肺损伤循环内皮祖细胞血管生成能力的影响。方法成年新西兰大耳白兔(2.5 kg～3.0 kg)共40只随机分为3组，正常对照组、急性肺损伤组、急性肺损伤组+乌司他丁治疗组分别采用免疫组化法观察肺毛细血管密度，病理评价肺泡炎症。检测体外内皮祖细胞成血管能力。结果HE染色评估肺泡炎症发现急性肺损伤与乌司他丁治疗组差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组化观察到乌司他丁治疗组肺毛细血管密度较正常对照组、急性肺损伤组增加(P<0.05)；在体外进行细胞培养同样发现乌司他丁治疗组内皮祖细胞的成血管能力较正常对照组、急性肺损伤组提高(P<0.05)。结论乌司他丁注射液能提高急性肺损伤循环内皮祖细胞成血管能力。

关键词：急性肺损伤；内皮祖细胞；乌司他丁注射液；成血管能力

急性肺损伤时内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)参与到肺泡-毛细血管的修复，2008年内皮祖细胞移植至油酸诱导的急性肺损伤兔模型[1]的研究已证实，在急性肺损时内皮祖细胞可归巢到肺毛细血管，起到修复肺损伤的作用，在最近的研究中也有类似的研究。2013年在Chest[2]发表的一项研究中发现单独使用内皮祖细胞或单独使用辛伐他丁均能减轻急性肺损伤，如联合治疗效果更好，研究没有更深入讨论机制研究，实验提示内皮祖细胞可进行急性肺损伤修复，并且利用药物提高内皮祖细胞功能是研究的一个重要手段及研究热点。乌司他丁注射液(ulinastatin injection，UTI)具备了治疗急性肺损伤的潜力。乌司他丁是从健康尿液中提取的蛋白酶抑制剂，可有效地减轻炎症渗出及炎症因子的释放[3]，也有研究证明它有利于内皮细胞修复及维持动脉内膜完整，现主要的研究偏向于乌司他丁减轻炎症因子或中性粒细胞从而减低内皮细胞的损伤，但暂未见乌司他丁和内皮祖细胞的研究。为此，本研究主要针对乌司他丁是否提高内皮祖细胞成血管能力展开。

1材料与方法

1.1实验动物成年新西兰大耳白兔(2.5 kg～3.0 kg)共40只，购自广东省动物中心，根据国家实验动物健康使用规范指南饲养，所有操作符合广东省人民医院伦理委员会的要求。

1.2材料与试剂M199培养液、胎牛血清购自Hyclone 公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；体外血管形成试剂盒、DIL-labeled acetylated LDL(Dil-acLDL)、FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITCUEA-1)、oleicacid(75 mg/kg)均购自Sigma公司。VWF抗体(博奥森)；ChemMate TM DAKO Envision TM Detection Kit (DAKO)，乌司他丁注射液(天普洛安)。PKB阻断剂(LY-294002)；eNOS阻断剂(L-NAME)。

1.3方法

1.3.1分组肺毛细血管密度分3组：正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共10只，进行免疫组化观察肺毛细血管密度；病理评价肺泡炎症。急性肺损伤兔组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共10只。造模成功24 h进行分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度；病理评价肺泡炎。乌司他丁治疗组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共10只，造模成功后使用40 000 U/(kg·d)乌司他丁治疗48 h后处死实验动物，分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度；病理评价肺泡炎症。

体外内皮祖细胞成血管能力检测分为3组：正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共6只，抽取10 mL外周血分离诱导内皮祖细胞7 d后，行内皮祖细胞鉴定。48 h后，检测成血管能力测定。急性肺损伤组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共6只，造模成功24 h后，抽取10 mL外周血，分离诱导内皮祖细胞。48 h后，检测成血管能力测定。乌司他丁治疗组：正常新西兰大耳兔，体重(2.0±0.5)kg，均为雄性，共6只，造模成功24 h后，抽取10 mL外周血，分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000 U/mL乌司他丁培养48 h后，检测成血管能力测定。

1.3.2EPCs的分离培养肝素抗凝取骨髓10 mL，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，接种在24孔板上。应用M199培养基(含20%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)培养，用PBS洗去非贴壁细胞。换培养液后培养至7 d，PBS液去除非贴壁细胞，对贴壁细胞进行细胞鉴定。

1.3.3EPCs的鉴定按2×106～3×106接种在纤连蛋白包被24孔板，细胞爬片培养第4天取出，将细胞与2.4 ng/mL的DIL-acLDL在37 ℃温度下孵育1 h，以检测EPCs摄取DIL-acLDL。采用2%多聚甲醛固定细胞10 min。应用PBS清洗2 min，10 ng/mL的FITC-UEA-1加于上述标本，37 ℃温度下孵育1 h。采用激光共聚焦显微镜鉴定DIL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。

1.3.4病理切片评估肺泡炎症部分左肺组织经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后用普通光学显微镜观察形态学变化。根据肺泡炎症的特点炎症细胞渗出，肺泡间隔增大，根据受损面积肺泡炎症分级：0级，无肺泡炎；Ⅰ级，轻度肺泡炎，少于20%的肺病灶区；Ⅱ级，中度肺泡炎，病变区20%～50%；Ⅲ级，弥漫 病变面积大于50%。

1.3.5EPCs血管生成能力检测采用体外血管生成试剂盒检测体外EPCs的血管生成能力。200倍倒置显微镜下观察小血管生成情况。细胞拉长变形，长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。选择200倍光镜下5个视野，计数小管数。

1.3.6免疫组化评估肺毛细血管密度血管性血友病因子(von willebrand factor VWF)是内皮细胞的标志物，经常被用于病理切片上确定毛细血管数目，按免疫组化试剂盒步骤，应用免疫组化图像自动分析模块，计算阳性目标总面积/统计场总面积，即每平方毫米的毛细血管密度。

1.3.7统计学处理采用SPSS 13.0统计软件分析，体外成血管能力检测、肺毛细血管密度方差分析，肺泡炎症评估采用秩和检验。

2结果

2.1肺部HE染色急性肺损伤见肺部严重渗出，经乌司他丁治疗后渗出较急性肺损伤组减少。根据受损面积肺泡炎症分级，急性肺损伤组与乌司他丁治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1　急性肺损伤组及乌司他丁治疗组肺泡炎症评估 　只

2.2肺毛细血管密度棕色染色为血管性血友病因子抗体阳性，肺毛细血管密度比较乌司他丁治疗组较急性肺损伤组明显增加(P<0.05)。详见表2。

表2　3组血管密度比较(±s)

2.3内皮祖细胞鉴定共聚焦显微镜观察EPCs摄取荧光双染阳性： DiL-acLDL染色细胞呈红色；FITC-UEA-I染色细胞呈绿色；双染色细胞同时呈红、绿色。通过共聚焦显微镜鉴定，FITC-UEA-I 和DiL-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

2.4体外EPCs血管生成能力检测急性肺损伤组较正常对照组体外成血管数目下降，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；乌司他丁治疗组较急性肺损伤组体外成血管数目增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3　3组成血管能力检测比较(±s)

3讨论

现有的研究主要考虑乌司他丁的内皮保护作用为炎症因子下降及炎症细胞减少导致内皮功能保护[4-6]。但在我们的实验中已发现乌司他丁能增加内皮祖细胞的归巢数目，在体内经免疫组化观察到肺毛细血管密度增加，在体外进行细胞培养同样发现经乌司他丁组治疗后内皮祖细胞的成血管能力提高。为此，认为乌司他丁的内皮保护作用，作用于内皮祖细胞，导致内皮功能改善，修复肺泡毛细血管屏障，减少肺部渗出。

内皮祖细胞在内皮保护起到主要的作用，内皮祖细胞组织归巢至受损的肺毛细血管起到修复的作用。有研究表明在急性肺损伤动物模型中大约有50%的肺毛细血管丢失，所以利用内皮祖细胞拯救肺毛血管是现在新的研究方向。参与肺血管[7]的修复有以下研究：Suratt 等[8]的研究认为内皮祖细胞参与内皮修复提供了强有力的证据，证明内皮祖细胞参与肺血管的修复，在接受男性造血干细胞移植的女性病人肺组织中(活检或尸检)观察到含有Y染色体的内皮细胞，证明外源性内皮祖细胞在受者肺组织中定植并分化为成熟的内皮细胞。内皮祖细胞可减轻氧化应激反应，在研究中发现，油酸诱导的急性肺损伤兔的肺中线粒体中的血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、锰超氧化物歧化酶(Mn super oxide dismutase)蛋白水平升高，这两种酶对抵抗肿瘤坏死因子(TNF-α)介导的内皮损伤及凋亡起到重要作用[1]。内皮祖细胞除了直接的内皮修复作用还有免疫调节功能 保护减少细胞内黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，P-选择素(P-selectin)蛋白使炎症细胞渗出减少[9]。

从本实验可以发现内皮祖细胞能归巢至受损的肺血管及参与肺血管内皮修复和血管新生。并且发现乌司他丁有直接引起内皮祖细胞成血管功能提高的作用。

参考文献：

[1]Lam CF，Liu YC，Hsu JK，et al.Autologous transplantation of endothelial progenitor cells attenuates acute lung injury in rabbits[J].Anesthesiology，2008，108：392-401.

[2]Li H，Qiang Y，Wang L，et al.Repair of lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by endothelial progenitor cells，alone and in combination with simvastatin[J].Chest，2013，144(3)：876-886.

[3]Zhifeng Z，Ning Y，Gang Z，et al.Preventive effect of ulinastatin and gabexatemesylate on post-endoscopic retrograde cholangiopancreatography pancreatitis[J].Chinese Medical Journal，2010，123(18)：2600-2606.

[4]Bae HB，Jeong CW，Li M，et al.Effects of urinary trypsin inhibitor on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rabbits[J].Inflammation，2012，35(1)：176-182.

[5]Rui M，Yunyou D，Xinhong Z，et al.Urinary trypsin inhibitor attenuates seawater-induced acute lung injury by influencing the activities of nuclear factor-κB and its related inflammatory mediators[J].Respiration，2012，83：335-343.

[6]Komori M，Takada K，Tomizawa Y，et al.Urinary trypsin inhibitor improves peripheral microcirculation and bronchospasm associatied with systemic anaphylaxis in rabbits in vivo[J].Shock，2003，20(2)：189-194.

[7]Mei M，Xilin X，Yong Z，et al.Endothelial progenitor cells：the promise of cell-based therapies for acute lung injury[J].Inflamm Res，2013，62：3-8.

[8]Suratt BT，Cool CD，Seris AE，et al.Human pulmonary chimerism after hematopoietic stem cell transplantation[J].Am J Respir Crit Care Med，2003，168(3)：318-355.

[9]Cao JP，He XY，Xu HT，et al.Autologous transplantation of peripheral blood-derived circulating endothelial progenitor cells attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits by direct endothelial repair and indirect immunomodulation[J].Anesthesiology，2012，116：1278-1287.

(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2015-12-19)

中图分类号：R563R256.1

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．011

文章编号：1672-1349(2016)06-0594-03

通讯作者：谢南姿，E-mail：luobangzhen100@sina.com

基金项目：国家自然科学基金(No.81000244)；上海市自然科学基金(No.12ZR1428400)