不同粒径聚酯底物的微生物降解

王宏阳， 巩继贤， 李辉芹， 李 政， 李秋瑾， 张健飞

(1. 天津工业大学 纺织学院， 天津 300387；2. 天津工业大学 先进纺织复合材料教育部重点实验室， 天津 300387)

不同粒径聚酯底物的微生物降解

王宏阳1,2， 巩继贤1,2， 李辉芹1,2， 李 政1,2， 李秋瑾1,2， 张健飞1,2

(1. 天津工业大学 纺织学院， 天津 300387；2. 天津工业大学 先进纺织复合材料教育部重点实验室， 天津 300387)

为研究形态结构对高聚物底物生物反应性的影响，分别以不同粒径的聚酯粉末为唯一碳源培养菌种，通过检测菌株生物量、发酵液中产物种类与浓度以及聚酯底物结晶度变化，研究菌株对底物尺寸结构的生物反应性影响。结果表明：以粒径小的粉末作为底物时，菌株的生长速率和生物量都远大于底物粒径较大的情况；在培养过程中，不同粒径底物发酵液中产物种类不尽相同，产物浓度的变化规律不同；菌株更易降解小粒径颗粒，且主要作用于无定形区域。

生物催化； 聚酯； 粒径； 生物反应性

聚酯(PET)织物具有良好的洗可穿特性，在纺织服装行业被广泛应用，但由于疏水、导湿性差导致服用时闷热、不舒适，也限制了其在生物医学、生物工程组织上的应用[1-2]。采用生物加工方法实现聚酯亲水性能的提升成为近几年研究热点，但与聚酯有关的生物加工研究一直进展缓慢，高效生物催化剂的缺乏是重要的制约因素[3]。最初，人们拟从可催化酯键的脂肪酶(Lipase)、酯酶(Esterase)等已商品化酶中，筛选可用于催化PET水解的酶[4-5]，由于效果不理想，又转而从环境中进行有关微生物的筛选与分离[6-7]。至今，PET分解菌的筛选基本是以PET单体模拟物为底物碳源进行微生物的培养，从而分离出利用PET单体模拟物的菌株[8-9]，但是，PET单体模拟物毕竟属于小分子物质，与高聚物有本质区别。

通过进化工程的方法[10]，选育出以PET为唯一碳源的高效降解菌。为研究高聚物底物形态结构对生物反应性的影响，以不同粒径的PET超细粉末为底物碳源培养微生物。通过检测菌株生物量的变化、发酵液中产物种类与浓度变化，分析底物粒径对菌株生长及其对产物形成与细胞利用过程的影响。

1 实验部分

1.1 菌 株

睾丸酮丛毛单胞菌，天津工业大学纺织学院生态染整课题组培育。

1.2 试剂与药品

PET切片(西格玛奥德里奇中国公司)；对苯二甲酸(TA,天津市光复精细化工研究所)；苯甲酸(BA，天津市化学试剂三厂)；双(2-羟基乙基)对苯二甲酸酯(BHET)、 原儿茶酸(PA，天津市希恩斯生化科技有限公司)；黏康酸(MA，阿法埃莎化学有限公司)；磷酸、甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)。

1.3 仪器与设备

HZQ-Q型全温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；WND-100型高速中药粉碎机(浙江省兰溪市伟能达电器有限公司)；LC-15C型反向高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津有限公司)；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)； V-1200型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；DL-101-2ES型电热鼓风干燥箱(天津市中环实验电炉有限公司)；D8 DISCOVER GADDS型X射线衍射仪(XRD，德国Bruker AXS公司)；TM-1000型扫描电镜(日本日立公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 不同粒径PET超细粉体颗粒的制备

取一定量PET切片，150 ℃烘36 h，充分干燥。取出后转入高速中药粉碎机进行粉碎加工，分别用360目和500目标准筛网反复过筛，制得粒径大于40 μm、25～40 μm和小于25 μm的3种PET超细粉体颗粒。

1.4.2 PET分解菌培养降解

培养基的配制参照文献[11]方法：准确称取NH4Cl 1 g、KH2PO43 g、Na2HPO47 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、H3BO30.5 μg、FeCl3·6H2O 0.2 μg、MnSO4·5H2O 0.4 μg、ZnCl20.4 μg、CuSO4·5H2O 40 μg、(NH4)6Mo7O24·7H2O 0.2 μg及水1 000 mL，充分溶解后量取100 mL加入到500 mL锥形瓶中， 120 ℃灭菌20 min。

菌株的培养：称取0.1 g PET粉末添加到灭菌后培养基中，转接20 mL出发菌株培养液， 37 ℃，140 r/min振荡培养，定期取样测试。

1.5 测试方法

1.5.1 粉末的形态结构观察

对经过粉碎过筛的粉末，采用日立TM-1000扫描电镜(SEM)对其形态结构和尺寸进行观察。观察前要先进行粉末的干燥处理。

1.5.2 生物量的检测

通过可见分光光度计测量微生物发酵液的光密度(OD值，optical density)来表示菌液的浓度，即每隔一定时间将菌株摇瓶取出，静置4～6 min，取锥形瓶中部发酵液3 mL置比色皿中，观察可见分光光度计波长为600 nm的吸光度。

1.5.3 发酵液中产物的检测

培养过程中每隔一定时间取样2 mL留做高效液相色谱测试。色谱条件：色谱柱InertSustain C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为40 ℃；流速为1 mL/min；进样体积为1 μL；检测波长为240 nm；流动相为pH值为2.02的60%的CH3OH和0.05 mol/L KH2PO4缓冲溶液。

1.5.4 X射线衍射分析

采用德国Bruker AXS公司的D8 DISCOVER GADDS型X射线衍射仪对经菌株处理前后不同粒径PET粉末的结晶行为进行分析。2θ范围设为4°～40°。

2 结果与讨论

2.1 底物粒径结构对产物组成的影响

菌株生长情况能够表示微生物对底物的利用率，但这对高聚物底物的生物催化分解情况只是间接的反映。为获得微生物培养条件下，底物形态结构影响PET生物催化分解的直接信息，分别以粒径大于40 μm和小于25 μm的2种PET超细粉末作为底物，进行PET分解菌的培养，培养一定时间后对发酵液取样分析，得到不同时刻发酵液样品的高效液相色(HPLC)谱图。

通过对比零时刻发酵液的色谱图与标准物质谱图(如图1所示)可知，在实验色谱条件下，发酵液中的主要产物为保留时间rt为3.16 min时的PA、rt为 3.28 min时的MA、rt为 6.33 min时的BA，rt为 4.01 min处出峰，可推测是以对苯二甲酸为主的物质(TA-m)(TA、3-羟基苯甲酸、BHET)。据文献[12]报道，酶水解PET纤维产生一定量的TA、BA、BHET等物质，但是在酶处理PET膜或纤维样品的研究中，尚未见对PA和MA的报道。

图1 标准物质与零时刻发酵液样品液相谱图对比Fig.1 Comparison of HPLC chromatogram between fermentation liquid and standard substance

将2种粒径底物在各时刻的发酵液样品HPLC谱图进行对比，如图2所示，可发现，培养相同时间的2种发酵液中，产物的种类不尽相同。

通过HPLC谱图对比可知，在以不同粒径底物培养菌株条件下，存在一些相同的产物，如PA、MA、BA、TA-m，而且这些物质所形成的峰面积比较大，即这些物质在发酵液中的浓度相对较大，是PET降解的主要产物。随培养时间的延长，不同粒径PET的分解产物浓度变化幅度明显不同，说明微生物对PET颗粒的利用程度不同，小粒径颗粒更易被分解利用。

图2 不同粒径PET底物培养菌株发酵液的谱图对比Fig.2 HPLC chromatogram of fermentation liquid with different particle size PET substrate

从HPLC谱图中也可清楚地看出，2种条件下除几种主要产物外还存在出峰位置不一致的产物，这说明尽管底物化学结构完全相同，但是在整个培养过程中，粒径不同的底物所形成产物的种类也不是完全相同的，如图2(a)、(d)中rt=5.28 min出峰处，在同一时刻，该物质在微生物利用小粒径颗粒时能够被代谢产生，但对于大粒径底物则不能被分解产生。

2.2 底物粒径结构对菌株生长的影响

底物的分解和摄入为菌株的生长代谢提供碳源，生长情况也反映出菌株对底物的利用效率。分别准备了粒径大于40 μm、小于25 μm和尺寸介于25～40 μm之间的PET超细粉末，作为底物进行PET分解菌的培养。不同粒径结构底物对菌株生长的影响情况如图3所示。由图可见，粒径小的PET粉末作为底物时，无论是对数期的生长速率，还是稳定期的最大生物量，都远大于粒径较大的底物。这说明对于PET这样的高聚物底物而言，粒径尺寸等形态结构因素对菌株的生长有显著影响。

图3 不同粒径PET粉末对菌株生物量的影响Fig.3 Effects of PET substrate with different particle size on growth of strains

葡萄糖等可溶性小分子类常规底物能够被微生物直接摄入细胞内而进入代谢系统，但像PET这样的不溶性高聚物底物，不能直接被细胞利用。有研究[9]认为，在以聚酯类物质作为底物的生物过程中，首先需要细胞分泌出一定的胞外酶。在酶的催化作用下，聚合物的大分子链发生化学键的断裂和分解。随生物催化分解反应的进行，会陆续产生短链物质。当分子链足够短的时候，这些分解产物就可溶解在发酵液中，成为可溶性物质。这些可溶性小分子产物可被细胞摄入，参与细胞内代谢过程。

作为底物的高聚物大分子在胞外酶作用下分解，是整个过程的限速步骤。因胞外酶不能进入高聚物内部，高聚物底物的生物催化分解反应只能在其表面进行，因此，高聚物底物的比表面积对于相应生物过程有重要影响。就本文研究而言，作为底物的PET粉末粒径越小，其比表面积越大，越易被酶催化分解，产生的小分子物质越多，从而能给菌株提供更多的碳源，有利于菌株的生长。

PET切片经充分粉碎，反复过筛即得大于40 μm、25～40 μm和小于25 μm的颗粒。不同粒径颗粒是粉碎过程自然形成，即在同一研磨工艺下获得不同粒径颗粒，虽然存在剪切应力和热作用，但是对于粉碎后获得的微米级颗粒其结晶程度和相对分子质量基本保持一致，这样保证了整个研究在相同平台进行。大于40 μm和小于25 μm的粉末颗粒用电镜对形态结构观察的结果如图4所示。

图4 研磨过筛后的不同粒径PET粉末电镜照片(×200)Fig.4 Screening of different particle size PET powder after grinding PET powder(×200). (a) Less than 25 μm;(b) Larger than 40 μm

聚酯切片成分中含有30%玻璃增强颗粒，图中白色棒状物质即为玻璃颗粒。由于玻璃成分的主要元素是氧和硅，且稳定性很好，所以不影响实验材料作为碳源的应用。通过电镜图片可清晰地观察到，经过研磨过筛后的颗粒粒径显著不同。图4(a)为平均粒径小于25 μm的粉末，图4(b)为平均粒径大于45 μm的粉末，并且粉末形状基本为椭圆球状。

2.3 底物粒径结构对产物浓度的影响

尽管不同粒径结构底物发酵液中产物组成不尽相同，但几种主要产物在这2种发酵液中都被检测到。为进一步研究底物粒径对产物形成的影响，分别对不同粒径底物发酵液中主要产物浓度变化进行了比较，如图5所示。

图5 不同粒径PET底物的发酵液中主要产物含量变化对比Fig.5 Comparison of concentration changes of main product in fermentation liquid with different particle size of PET substrate

比较不同粒径底物发酵液中主要产物浓度变化可发现：PET粒径小于25 μm的发酵液中，几种主要产物浓度波动比较大；而对于PET粒径大于40 μm的发酵液，在整个培养过程中几种主要产物浓度基本呈下降趋势。说明以不同粒径PET作为底物碳源培养菌株过程中，微生物对粒径小于25 μm的PET的利用程度远大于40 μm的情况。

随着PET在胞外酶作用下，小分子物质不断产生，继而又会被细胞分解而利用。在整个生物催化过程中，细胞生长和代谢情况是变化的，细胞所分泌酶的数量和活性也是不均匀的，导致各种产物的分解速率差异；菌株各生长阶段细胞的数量和代谢情况也不一样，导致菌株对发酵液中产物的利用速率差异。正是产物的形成、分解和细胞摄入等3种因素的共同作用，使得发酵液中产物浓度呈波动状态，因此，在PET粒径大于40 μm的发酵液中，几种主要产物浓度一直减少，是因为颗粒比表面积较大，PET的生物催化效率较低，产物形成的量较少，甚至抵不上因细胞利用而消耗的量。

当以小粒径PET发酵培养至24 h时，菌株处于对数生长期末期，此时底物降解最为活跃，产物种类和浓度最为丰富，所以PA、MA、TA-m的浓度明显提高，但BA是4种中间产物中最易被分解利用的小分子物质，所以在PET生物催化的对数末期，BA在较短时间就会被分解掉。当以大粒径PET为底物时，菌株生长不存在明显对数生长，对PET降解能力显著降低，只能依靠发酵液已有中间产物作为碳源维持生长，所以几种产物浓度基本呈现下降趋势。而BA在培养至24 h时浓度有所提高，可能是由于一些PET降解产物继续被菌株分解出BA,而此时菌株数量不足以快速代谢BA，便造成了BA的浓度上升。

2.4 菌株处理对PET底物结晶性能的影响

根据文献[13-15]，经过酶处理的PET结晶度显著提高，说明大分子的非晶区更易受到酶分子的作用而发生降解作用。实验中采用菌株发酵液对不同粒径的PET颗粒进行3周的降解处理，定期补加新鲜菌液，最后收集底物粉末进行X射线衍射测试。对于粒径小于25 μm的颗粒，经过3周菌株处理，粉末的结晶度由9.35%提高到14.38%。而粒径大于40 μm的颗粒,结晶度由9.08%提高到10.39%。由此可知：不同粒径粉末对菌株的生物反应性不同，小粒径粉末比表面积大更易被利用；而菌株对PET粉末的作用主要集中在分子链运动相对活跃的无定形区域发生有效分解，从而导致PET颗粒结晶度增加。

3 结 论

聚酯的粒径结构对菌株的生长有显著影响，粒径小的粉末作为底物时，无论是对数期的生长速率，还是稳定期的最大生物量，都远大于粒径较大的底物；不同粒径聚酯发酵液中主要产物的种类不尽相同，都含有黏康酸、苯甲酸等，但浓度的变化规律不同，粒径小的聚酯粉末作为底物时，产物浓度变化波动比较大；而粒径大的条件下产物浓度波动基本呈下降趋势，且处于较低的水平。经过菌株的长期处理，小粒径的聚酯颗粒结晶度明显提高。鉴于当前聚酯材料的加工多为化学过程，对生物催化剂进行耐酸、耐碱和耐热等工业适应性改造，以实现工业环境下的聚酯高效生物催化，将是PET生物加工技术将来重要的发展方向。

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Microbial degradation of polyester substrates with different particle sizes

WANG Hongyang1,2, GONG Jixian1,2, LI Huiqin1,2, LI Zheng1,2, LI Qiujin1,2, ZHANG Jianfei1,2

(1.SchoolofTextiles，TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China; 2.KeyLaboratoryofAdvancedTextileCompositesofMinistryofEducation,TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China)

The effect of different particle sizes of polyethylene terephthalate (PET) as substrates on the growth of strain was measured by monitoring concentration changes of strains, products and variety of crystallinity. Another purpose is to explore the role of the substrate size structure in product formation and used by cells. The results showed that when the smaller PET powder as a substrate, the growth rate and biomass of strains were much greater than those when the substrate has a larger size. During the culture process, the composition of products detected in the fermentation liquid varied with the substrate size. And the smaller particles are more easily degraded, which occurred mainly in the amorphous region.

biocatalysis; polyethylenc terephthalate; size; bioreactive

10.13475/j.fzxb.20150400506

2015-04-06

2015-09-20

生态纺织(江南大学)教育部重点实验室开放基金项目(KLET1101)

王宏阳(1990—)，男，硕士生。研究方向为聚酯材料的生物改性。巩继贤，通信作者，E-mail：gongjixian@126.com。

O 63；Q 819

A