猴源GII.17 型诺如病毒基因组 P 结构域及其变体的原核表达、纯化和抗原性鉴定

刘 波, 李 超, 陶玉芬, 李昕潼, 刘建生, 和占龙, 刘红旗

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所, 昆明650118)

猴源GII.17 型诺如病毒基因组 P 结构域及其变体的原核表达、纯化和抗原性鉴定

刘 波, 李 超*, 陶玉芬, 李昕潼, 刘建生, 和占龙, 刘红旗

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所, 昆明650118)

目的 表达、纯化和鉴定猴源GII.17型诺如病毒(NoV)基因组P结构域及其变体蛋白。方法 基于本实验室获得的猴源GII.17型NoV 基因组P结构域的核苷酸序列，按大肠杆菌密码子使用的偏好性优化P结构域的核苷酸序列，人工合成相应的基因。以此基因为模板，通过PCR方法扩增得到P结构域的变体基因。采用无缝连接的方法将P结构域基因及其变体克隆到原核表达载体，进行蛋白诱导表达和纯化。最后，通过免疫印迹法和ELISA法分析表达蛋白的抗原性。结果 测序结果表明，P结构域及其变体成功地克隆至原核表达载体。SDS-PAGE分析显示，P结构域在原核细胞的超声裂解上清和沉淀中都有表达，而其变体主要表达于上清。免疫印迹和ELISA结果显示，表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白具有很好的抗原性。表达的蛋白免疫小鼠制备的相应抗体ELSIA效价可达到1∶32 000。结论 成功地表达了猴源GII.17 NoV基因组 P结构域及其变体蛋白，并且通过免疫小鼠得到了相应的抗体，为后期检测试剂盒的研发、病毒鉴定和病毒受体结合实验奠定了基础。

猴; 诺如病毒基因组; P结构域; 蛋白表达; 抗原性

诺如病毒(Norovirus, NoV)是导致非细菌性急性胃肠炎的主要病原体, 是近年来导致人类由腹泻引起的发病率和死亡率增高的主要原因[1]。该病易在医院、疗养院、学校等人员密集、半封闭的环境中引起暴发性流行[2,3]。尽管所有年龄人群对该病毒均敏感，但该病毒对儿童和免疫缺陷人群健康的威胁最为严重[4,5]。人群中NoV自1990年代首次确认到2014年, 世界范围主要流行GII.4基因型。近年来, GII.17型开始出现, 并且成为亚洲主要流行基因型[6-8]。有报道[9-11]人NoV也能感染猪和犬等动物。

NoV属于杯状病毒科诺瓦克病毒属，直径为26～35 nm, 无包膜, 球形, 呈二十面体对称，基因组为单股正链 RNA，全长约为 7.5 kb, 包含三个开放阅读框(ORF)。ORF1长约5 kb，编码非结构蛋白，经翻译后修饰成 6个功能蛋白。ORF2 长约1.8 kb, 编码541个左右氨基酸的衣壳蛋白(VP1)。VP1蛋白折叠成两个区域: 壳区(S区)和突出区(P区)，其中S区为VP1的内壳，P区位于VP1结构的壳外, 包含P1和 P2两个亚区, P2亚区位于衣壳蛋白的最外层, 易发生变异。ORF3长约 0.6 kb，编码一个微小结构蛋白(VP2)，VP2蛋白的具体功能还不是很清楚，它可能参与病毒衣壳的构建，也可能有助于整个衣壳蛋白的稳定。VP1蛋白的P区是病毒首先与受体结合的区域[12]，也是诱导中和抗体的主要抗原区[13]。因此，P区域不仅是研究病毒感染机制的靶点，也是疫苗研究的重点区域。

NoV的研究有两大难点，一方面该病毒目前还不能在体外培养，另一方面还没有人NoV感染的动物模型，这两方面给该病毒的致病机理研究和疫苗研发带来极大的阻力[14,15]。近期，作者课题组从猴粪便样品中获得了GII.17型NoV基因组，本研究基于获得的GII.17型病毒序列，根据大肠杆菌密码子偏好，对VP1的P结构域核苷酸序列进行了优化，通过人工方法合成了P结构域基因后，定向克隆到原核表达载体中，通过诱导表达和纯化得到了P结构域及其变体蛋白。ELISA和免疫印迹法确定目的蛋白具有良好的抗原性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级8周龄雄性BALB/c小鼠，由全国医学灵长类研究中心小动物实验部(中国医学科学院医学生物学研究所)提供[SYXK(滇)2010-0007]。所有操作均按照医学生物研究所动物实验伦理委员会要求进行。

1.2 病毒、质粒和菌株

猴源(猕猴)GII.17型NoV基因组和原核表达质粒pGEX-4T1由本实验室保存。E.coli BL21(DE3)菌株和E.coli DH5α菌株购自天根生物技术公司。

1.3 主要试剂

限制性内切酶、无缝拼接试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR体系采用 GoTaq@G2 Green Master Mix购自美国 Promega 公司。ECL (Enhanced chemiluminescent method )底物显色剂和BCA(二喹啉甲酸)蛋白定量分析试剂盒购自美国Thermo公司。GST(Glutathione S-transferase)Trap FF 纯化柱购自德国GE公司。抗GST单克隆抗体购自美国CST公司。佐剂购自北京博奥龙免疫技术有限公司。HRP标记的抗鼠IgG抗体购自美国CST公司。

1.4 病毒基因及引物设计

基于研究组获得的猴源GII.17NoV基因组的P结构域核苷酸序列，根据大肠杆菌密码子表达的偏好性对P结构域核苷酸序列进行了优化，优化后的氨基酸序列没有改变且对蛋白结构不造成影响。由北京唯尚立德生物科技有限公司技术人员进行优化并合成基因。

根据无缝拼接试剂盒的要求，设计P结构域及其变体特异性引物(美国Invitrogen公司合成)。

P-RGD: 上游引物5′-T CTGGTTCCGCGTGGATCCTCTAAAACCAAACC-3′;

下游引物(1) 5′-GCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCACTGCGCACGACGG-3′;

(2) 5′-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTTAGCAGAAGCAGTCACCAC-3′。

P ΔR: 上游引物5′-TCTGGTTCCGCGTGGATCCTCTAAAACCAAACC-3′;

下游引物5′-CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTTACCCATTCCCGGTGC-3′

1.5 重组质粒的构建

为了便于后续的研究, 设计P结构域引物时, 加入了一段编码RGD的核苷酸序列, 称之为P-RGD。去掉P结构域C端富含精氨酸的部分得到P结构域变体, 称之为PΔ R。用限制性内切酶BamH I和Not I酶切表达载体pGEX-4T1。通过无缝拼接试剂盒分别将纯化的PCR目的片段与线性化的载体进行连接。连接产物转化感受态E.coli DH5α。鉴定为阳性的克隆经测序确认。测序正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取含目的质粒菌株进行诱导表达或冻存保种。

1.6 P结构域及其变体的诱导、表达和纯化

过夜培养菌体以1∶50转接入新鲜含抗生素的LB培养基继续培养，待吸光值A600达到约0.5时，加入终浓度为0. 5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于22℃、220 r/min过夜诱导培养。次日，收集菌体，超声破碎，通过考马斯亮蓝染色鉴定蛋白表达形式。采用GST亲和柱纯化目的蛋白，然后通过超滤浓缩的方法更换缓冲液。牛凝血蛋白酶切割GST标签，再用GST亲和柱去除GST获得不含标签的目的蛋白，BCA蛋白定量试剂盒和考马斯亮蓝染色分别检测蛋白浓度和纯度。1.7 表达蛋白的抗原性检测

以40 μg蛋白辅以相等体积的佐剂免疫8周龄BABL/c小鼠。免疫完成后2周通过眼球采血获得小鼠血清。用酶联免疫吸附方法(ELISA)做血清学效价分析，以样品A450值与阴性对照A450值的比值(P/N)大于2判定样品为阳性。以免疫后小鼠血清(1∶1 000)作为一抗， 辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗IgG(1∶5 000)为二抗，进行免疫印迹分析蛋白的抗原性。

2 结果

2.1 P结构域及其变体原核表达载体的构建

P结构域(P-RGD)及P结构域变体(PΔ R)结构示意如图1A所示。以合成的基因为模板, 用P-RGD和PΔR特异性引物进行PCR扩增。电泳结果表明,得到了预期大小约1 kb的目的片段(图1B)。核苷酸测序结果表明, P-RGD基因片段大小为957 bp，PΔR为945 bp，与预期核苷酸序列一致。

2.2 P结构域及其变体的原核表达

P结构域及其变体的重组质粒表达后经SDSPAGE电泳和考马斯亮蓝染色分析，结果表明，没有进行密码子优化的基因，几乎检测不到其对应的蛋白表达(图2A)。而根据大肠杆菌表达的密码子偏好对其核苷酸序列进行优化后，与未进行诱导的对照相比，在相对分子质量为60 000Da的位置有明显表达的蛋白条带，与预期分子量相符。P-RGD以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，而PΔR以可溶性蛋白为主(图2B)。

2.3 P结构域及其变体蛋白的纯化和鉴定

P结构域及其变体蛋白通过GST亲和柱进行纯化后，SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色分析显示，2个蛋白在预期60 000Da的位置都有比较单一的条带(图3A)。进一步用抗GST单克隆抗体通过免疫印迹法进行了分析，确认纯化得到的蛋白为GST融合蛋白(图3B)。

图1 P结构域及其变体的PCR扩增

图2 P结构域及其变体的原核表达

图3 P结构域及其变体蛋白的纯化和鉴定

2.4 P结构域及其变体蛋白的抗原性

纯化得到的GST融合蛋白经牛凝血蛋白酶切割后，再次经GST亲和柱除去GST标签得到不含GST的目的蛋白(图4A)。用该蛋白免疫小鼠制备相应的抗血清。经免疫印迹分析显示, 尽管P-RGD诱导的抗体还含有抗GST的成分，但是P-RGD和PΔR与免疫后血清有特异的反应，说明纯化蛋白具有抗原性(图4B)。ELISA检测结果表明，我们所获得的血清效价均可达到1∶32 000(图5)。

3 讨论

尽管NoV性胃肠炎在大部分病人通常仅引起轻微症状，病程较短，且一般可自愈，但给生活带来极大困扰，影响工作和军人的战斗力[16]，尤其是对于儿童和免疫力低下或缺陷的人群，严重时可以导致死亡[4,5]。NoV的检测和疫苗免疫是目前防治该病的有效措施。本研究通过原核系统成功地表达和纯化了猴源GII.17型NoV的P结构域及其变体，并且证明了这两个蛋白具有很好的抗原性。

图4 P结构域及其变体蛋白的抗原性分析

图 5 抗P结构域及其变体血清效价测定

由于NoV目前无法在体外进行细胞培养[17]，因此，对于NoV的致病机制和疫苗的研究都是通过表达病毒蛋白进行细胞外实验研究。VP1是NoV的囊膜蛋白，在病毒与宿主的相互作用机制中起非常重要的作用，尤其是其突出区(P区)。P区在整个病毒粒子的最外面，是病毒与宿主细胞首先接触的部位，也是诱导中和抗体的关键区域。因此，通过表达P区蛋白用于病毒致病机制和疫苗免疫机理研究[12,18]。本研究的病毒基因组来自于猕猴，表达的P区蛋白为研究猴NoV感染以及将来建立和评价非灵长类动物人NoV感染模型打下了坚实的基础。P区蛋白在原核系统表达后，有时可以自行形成24聚体的纳米颗粒，显著增强其免疫原性。研究表明，在P结构域末端加一个RGD序列将有助于纳米颗粒的形成[13]。另外，P结构域C端的精氨酸聚集区对于其与受体结合起重要作用[18]。因此，本研究在P结构域的C端加了一个RGD序列，并且还构建和表达了不含精氨酸聚集区的P结构域变体，为将来猴唾液酸结合实验和其它病毒机制研究以及纳米颗粒疫苗研发奠定了基础。

原核表达系统是一个廉价和便捷的表达系统。然而，与真核表达系统相比，蛋白质的可溶性和翻译后修饰是该系统的两个不足之处[19]。本研究的P结构域与其变体蛋白的区别在于变体蛋白没有RGD和精氨酸聚集序列，这2个序列可能通过影响蛋白的P结构域从而影响蛋白的可溶性。

总之，本研究获得了具有较好抗原性的猴源GII.17型NoVP结构域及其变体蛋白, 为将来GII.17型NoV检测方法、唾液酸结合实验和疫苗等研究奠定了坚实的基础。

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Expression, Purification and Antigenicity of P Domain and Its Variant of Monkey GII.17 Norovirus Genome

LIU Bo, LI Chao, TAO Yu-fen, LI Xin-tong, LIU Jian-sheng, HE Zhan-long, LIU Hong-qi
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo express P domain and its variant of monkey GII.17 norovirus genome, purify protein and analyze antigenicity.MethodsThe gene of P domain was synthesized, following designation based on the nucleotide sequence that was obtained from monkey GII.17 norovirus genome and bias of E. coli. PCR with these specific primers was performed to amplify P domain and make its variant, followed by cloning into prokaryotic expression vector via in-Fusion ligation. Protein expression was induced by IPTG, purified through GST affinity column and analyzed by Coomassie staining, immunoblot and ELISA assay.ResultsSequencing results showed that P domain and its variant were successfully cloned into the expression vector. Analysis of SDS-PAGE revealed that P domain was observed in both the supernatant and pellet, and its variant was mostly expressed in the supernatant. The expressed and purified proteins were further confirmed by immunoblot analysis via the anti-GST antibody. The results of immunoblot analysis and ELISA assay indicated the good antigenicity of the proteins. The ELISA titers of antibodies induced by these proteins were 1∶32000.ConclusionThe P domain and its variant of monkey GII.17 norovirus genome were successfully expressed. The antibodies were obtained after immunization of mice with these two proteins. The findings of this study pave the way for the development of viral detection kit, viral identification and assay of virus-receptor binding.

Monkey; Norovirus genome; P domain; Protein expression; Antigenicity

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0334-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.002

2016-06-20

云南省应用基础研究计划项目(2013FZ143); 医学生物学研究所重点项目(2014IMB03ZD); 云南省创新团队(2015HC027)

刘 波(1990-), 女, 硕士研究生, 研究方向: 感染和免疫学。E-mail: LIUBO@imbcams.com.cn

*2014级硕士研究生

刘红旗, 博士研究生, E-mail: lhq@Imbcams.com.cn