慢性膀胱炎相关膀胱过度活动症大鼠模型的建立

高 峰, 张士更, 张 楠, 张布衣, 戴玉樑, 李绍江

(1. 浙江中医药大学第二临床医学院, 杭州 310053; 2. 浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科, 杭州 310009)

慢性膀胱炎相关膀胱过度活动症大鼠模型的建立

高 峰1, 张士更2, 张 楠2, 张布衣2, 戴玉樑1, 李绍江1

(1. 浙江中医药大学第二临床医学院, 杭州 310053; 2. 浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科, 杭州 310009)

目的 建立一种发病机制、尿流动力学表现与临床相近的慢性膀胱炎相关膀胱过度活动症(OAB)大鼠模型。方法 将40只雌性SD大鼠随机分为模型组和生理盐水对照组; 模型组以大肠埃希氏菌膀胱灌注，3 d后搜集尿液常规显微镜检查，证实膀胱炎并以庆大霉素灌胃每日4次，连续7 d，第10日复查尿常规，每隔10 d为1个周期，经4个周期后行尿流动力学检查及膀胱HE染色病理学检查。生理盐水对照组用等量生理盐水代替大肠埃希氏菌溶液，其余处理同模型组。2组同条件饲养。结果 模型组膀胱标本可见少量上皮组织退变、凋亡、脱落，黏膜固有层见散在的淋巴细胞，行尿流动力学检查确认13只建模成功。结论 通过大肠埃希氏菌ATCC35218反复膀胱灌注诱导SD大鼠慢性膀胱炎，最终可建立慢性膀胱炎相关OAB大鼠模型，为临床上常见的膀胱炎后OAB的发病机制及治疗、研究提供思路。

慢性膀胱炎; 膀胱过度活动症(OAB); 大肠埃希氏菌; 大鼠模型

膀胱过度活动症(overactive bladder, OAB)是泌尿系统常见的慢性疾病, 表现为尿急, 伴或不伴急迫性尿失禁, 可严重影响生活质量, 尿流动力学上表现为逼尿肌过度活动(detrusor overactivity, DO)[1]。目前在OAB的动物研究中多以家兔、大鼠制造膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO), 少数采用腹腔内注射环磷酰胺建立DO模型[2-4]。而临床上发现, 反复膀胱炎女性患者多并发OAB。因此本实验通过反复大肠埃希氏菌ATCC35218膀胱内灌注并予庆大霉素灌胃治愈, 探讨反复膀胱炎后是否导致OAB？拟通过建立膀胱炎相关OAB动物模型, 为进一步探索临床上常见的慢性膀胱炎后OAB发病机制及治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级雌性SD大鼠，40～45日龄，体质量150～180 g, 购自浙江中医药大学动物实验中心[SCXK (浙)2016-0009]。将40只大鼠按随机数字表法分成2组，模型组(A组, 20只)，生理盐水对照组(B组，20只)，分笼饲养，自由饮水。

1.2 仪器、试剂与菌种

尿动力检查仪(荷兰MMS公司, 型号: MMS Solar), 分光光度计(日本Hitachi公司, 型号: U-0080D), 正置显微镜(日本Olympus公司, 型号: CX41)，大肠埃希菌(杭州百思生物技术有限公司,标准标号: ATCC35218)。

1.3 实验方法

1.3.1 大肠埃希菌溶液的制备 从-70 ℃冰箱取出大肠埃希菌ATCC35218菌种，无菌条件下，挑起菌种用划线法接种在血平板上，置于37 ℃恒温，24 h后，挑取大肠埃希菌菌落至试管中，用生理盐水溶解，分光光度仪测定大肠埃希菌，保持浓度在1×108～1.2×108CFU/mL(接种及培养由浙江中医药大学附属第一医院检验科完成)。

1.3.2 膀胱灌注方法 无麻醉下抓取大鼠，反复挤压大鼠下腹部直至未见尿液流出。用碘伏连续消毒尿道外口及周围1 cm皮肤3次，剪去医用留置针针尖前部约0.5 cm，连接移液枪，灌注100 μL大肠埃希菌至膀胱内，保持3 min后将大鼠放回笼中正常饲养。

1.3.3 各组处理方法 A组大鼠膀胱内灌注大肠埃希菌ATCC35218(1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, 3 d后搜集尿液常规显微镜检查，后予庆大霉素(0.5 mL，2万单位)灌胃每日4次，连续7 d进行治疗，第10日复查尿常规，如此10 d为1个周期，共4个周期后行尿流动力学检查，并取膀胱标本行HE染色。B组用同等量生理盐水代替大肠埃希氏菌溶液，其余处理方法同模型组。2组同条件饲养。

1.3.4 DO检测及判定方法 将质量分数2%戊巴比妥以35 mg/kg腹腔注射，10 min后同膀胱灌注法常规消毒，尿道外口插入外径1 mm 软质硬膜外麻醉管入膀胱，经三通装置连接微量灌注泵与尿动力学检查仪，轻压腹部至排净尿液。膀胱灌注液采用37 ℃生理盐水，速度为0.05 mL/min，从灌注开始到排尿时停止。每只大鼠检测4次。若膀胱充盈期逼尿肌不稳定收缩波存在且2次及以上，则判定为阳性，即DO或OAB。若不稳定收缩波只出现1次，则第2日再次行尿动力检测，仍在1次及以下判定为阴性。

1.3.5 尿常规及病理检测 在各组大鼠尿流动力学检测结束后, 颈椎脱臼法处死, 迅速剪开下腹部皮肤,暴露膀胱, 用0.5 mL针筒抽取全部尿液, 离心沉淀后高倍镜镜检，以+(阳性，白细胞数＞5个/每高倍镜视野)或－(阴性, 白细胞数0～5个/每高倍镜视野)表示。取2组大鼠的膀胱组织固定后, 行常规组织切片, HE染色, 若A组大鼠出现DO的同时切片镜检膀胱上皮组织未见细菌菌落，上皮组织基本完好且未见大量炎症细胞浸润, 表明造模成功。1.4 统计学方法

将数据整理后录入EXCEL中，分析时读入SPSS19.0中进行数据分析，各组间采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

A组大鼠在大肠埃希菌灌注期间死亡2只, 庆大霉素灌胃期间死亡1只; B组在灌胃期间死亡2只，死亡大鼠均在处理后第2日发现。灌胃时个别大鼠在进针、推药时挣扎明显，放回笼中后略显虚弱及疲态，对刺激反应较差，可见类呕吐表现，第2日大鼠口腔中发现陈旧性血迹，考虑可能因操作不当至消化道穿孔或误注入气管引起。A、B组膀胱灌注后观察，A组个别大鼠趴在笼中类似寒战表现，偶见小范围跑动的异常兴奋表现，可能此时已出现感染性休克初期表现。

2.2 尿流动力学检测

在测量前将膀胱内压、腹压以及逼尿肌压力均设为0 cmH2O。A组膀胱充盈期不稳定收缩波明显增多，排尿时间明显(图1A); B组以出现一逼尿肌正常排尿的收缩波为主(P＜0.05)。此外，观察到首次收缩波出现时间也较B组提前(图1B)。

图1 大鼠尿流动力学排尿期收缩波

表1 各组大鼠膀胱充盈期不稳定收缩及4次尿白细胞阳性率比较

2.3 尿常规检查

4次尿常规白细胞检测: A组大肠杆菌膀胱灌注3 d后白细胞阳性率均为100%，治疗后阳性率在11.8%以下; B组膀胱灌注及治疗后阳性率在5.6%以下。A、B组膀胱尿流动力学检测阳性占比分别为76.5%、5.6%(表1)。这一现象符合临床治愈诊断且A、B组大鼠膀胱炎患病率出现差异(P＜0.05)。

图2 各组大鼠膀胱上皮病理学观察(HE×400)

2.4 膀胱组织学检查

A组死亡大鼠膀胱组织切片镜检可见上皮组织大量脱落，大量杆菌分布于黏膜，血管周围有菌落成团出现(图2A); A组大鼠治疗4个周期后膀胱上皮可见少量黏膜上皮退变、坏死、凋亡、脱落，较B组变薄，黏膜固有层轻微水肿, 出现散在淋巴细胞(图2B), 共13只大鼠造模成功, 成功率76.5%。B组大鼠镜下可见黏膜上皮完好，偶见凋亡脱落，未见大量炎症细胞及水肿形成(图2C)。

3 讨论

OAB目前已成为泌尿外科常见病, 在我国总体发病率约为6%, 40周岁以上人群发病率高达11.3%,其中男性约占5%，女性约占6%，随年龄增长发病率增高[5]。预计到2018年，全球范围约有5.46亿OAB患者。在部分西方国家OAB已成为十大常见慢性病之一，严重影响患者身心健康和工作，日益成为家庭及社会的沉重负担[6]。其发病机制尚不清楚，目前主要认为有两种机制，神经源性学说与肌源性学说，其中肌源性学说因Cajal 间质细胞的发现被广泛认可[7,8]。

膀胱炎多见于女性患者，以上行性感染多见。分为急性膀胱炎和慢性膀胱炎，临床上多见于慢性膀胱炎，约85%均由大肠埃希菌引起，其次为葡萄球菌，变形杆菌等。慢性膀胱炎由于膀胱感觉过敏，可出现尿频尿急等逼尿肌过度活动(DO)症状[5,9]。但经抗生素治疗尿常规白细胞阴性后，部分患者仍有DO症状; 其发病机制是由于膀胱炎并未真正治愈，还是反复膀胱炎症继发OAB等引起?目前国内外未见相关报道。

本实验通过大鼠膀胱内反复灌注大肠埃希菌建立慢性膀胱炎并以尿常规检测确认。在庆大霉素治疗至尿白细胞阴性后再行尿动力学检测。同时予膀胱HE染色镜检明确膀胱炎治愈情况，从而排除因膀胱炎直接引起DO症状的可能性。因雄性大鼠尿液可由输精管返流入精囊，改变膀胱内压，在尿流动力学检查过程中影响膀胱功能的评估，因此本实验全部采用雌性大鼠。

实验中， A组大鼠在灌注大肠埃希菌期间死亡2只，将死亡大鼠取出膀胱行HE染色，见大量上皮脱落，血管扩张充血，血管内见大量菌落成团。考虑可能由于尿路感染最终引起败血症、感染性休克而死亡。灌胃期间3只大鼠死亡，考虑主要为操作不当引起：灌胃致消化道穿孔或注射入呼吸道。A组在尿动力学检测中，膀胱充盈期不稳定收缩波较B组阳性率明显升高，具有统计学意义，表明造模成功，且逼尿肌收缩的时间早于B组，这一现象可能因膀胱感觉过敏引起。而A组仍有23.5%的大鼠尿动力学检测为阴性，分析原因:①所有大鼠均在麻醉过程中检测，由于麻醉可抑制逼尿肌的自发收缩活动和排尿反射，因此会出现一定概率的假阴性; ②膀胱炎病程较短，部分大鼠未能够造成病理生理改变，从而未引起DO。

目前在国内外OAB的动物研究中, 多数采用家兔、大鼠, 通过对尿道进行结扎、放置金属环等不同手段, 增加尿道排尿阻力, 从而模拟老年男性前列腺增生引起的DO模型[2,3]。而临床上女性患者OAB的产生多因反复慢性膀胱炎引起，并非长期的后尿道梗阻。本实验首次通过慢性膀胱炎为诱因建立DO模型。慢性膀胱炎造模参考既往文献[10,11], 采用大肠埃希菌膀胱内灌注, 浓度为1.2×108CFU/mL，通过该方法，可以成功建立慢性膀胱炎大鼠模型。然后，在该模型的基础上进一步建立DO模型。

临床上OAB的治疗并不理想，通过行为治疗，口服药物治疗等方法虽有一定疗效，但仍不能完全治愈，且长期用药易出现耐受[5]。因此，OAB的基础研究仍期待新的突破。过去的研究表明: 在BOO引起OAB的动物模型发现: 膀胱肌层内存在Cajal细胞(ICC细胞)，该细胞具有自发性电位，逼尿肌过度活动的逼尿肌中ICC细胞数量明显增加，细胞网络化更加明显[12]。本文提供了一种新的大鼠OAB模型建立方法，为进一步研究慢性膀胱炎与OAB以及膀胱炎后OAB与Cajal 间质细胞的相关性提供了动物实验基础，为膀胱炎相关OAB临床疾病预防和治疗提供新的思路。

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Establishment of Over Active Bladder Model Associated with Chronic Cystitis in Rat

GAO Feng, ZHANG Shi-geng, ZHANG Nan, ZHANG Bu-yi, DAI Yu-liang, LI Shao-jiang
(1. The 2nd Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Department of Urology, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo build the over active bladder (OAB) related to chronic cystitis model which is similar to clinical process including pathogenesis and urodynamic performance.MethodsForty female SD rats were randomly divided into model group and saline control group. Model group: the bladders were instilled with Escherichia coli ATCC35218 (1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, and a urine test were done after 3 days to confirm cystitis. The rats were given by gavage with Gentamicin (0. 5 mL, 2 million units) 4 times a day × 7 days and urine were retested 10 days a cycle. The rats were done urodynamics and HE staining for bladder tissue after 4 cycles. Saline control group: were given by gavage with the same amount of saline solution instead of Escherichia coli, the remaining process was the same as the model group. The animals were raised under the same conditions.ResultsA small amount of epithelial was found degeneration, apoptosis, loss, and scattered lymphocytes in the lamina propria in model group. Thirteen rats were successfully modeled.ConclusionThe OAB animal model can be established after cystitis by repeated E.coli infusion into bladder of female SD rats’. It offers ideas for pathogenesis, treatment and research about OAB associated with chronic cystitis.

Chronic cystitis; Overactive bladder (OAB); Escherichia coli; Rat model

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0340-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.003

2016-05-26

浙江省中医药科技计划项目(2012ZA058)

高 峰(1990-), 男, 硕士研究生。

E-mail: 934563340@qq.com

张士更(1973-), 男, 主任医师。

E-mail: 22676251@qq.com