全反式维甲酸增加胃癌细胞对放射的敏感性*

王艳萍， 赵先群， 张向东△， 许 威， 向晓辉

(1南阳市中心医院消化科， 河南 南阳 473000； 2中国人民武装警察部队后勤学院附属医院肝胆胰脾疾病诊疗中心， 天津 300162)

·短篇论著·

全反式维甲酸增加胃癌细胞对放射的敏感性*

王艳萍1， 赵先群1， 张向东1△， 许 威2， 向晓辉2

(1南阳市中心医院消化科， 河南 南阳 473000；2中国人民武装警察部队后勤学院附属医院肝胆胰脾疾病诊疗中心， 天津 300162)

目的： 研究全反式维甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)对胃癌细胞SGC-7901存活率与放射敏感性的影响，并讨论其可能的机制。方法: MTT法检测细胞存活率；平板克隆形成实验和流式细胞术分别检测细胞的放射敏感性和细胞周期；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中Bax、Bcl-2、survivin与NF-κB的mRNA表达。结果: ATRA可降低SGC-7901细胞存活率，当浓度到达8 μmol/L时，抑制作用达到最大；ATRA联合X射线处理后，与单纯放射处理相比，平均致死剂量(D0)和准阈剂量(Dq)显著变小(P<0.05)，且拟合的生存曲线明显下移；ATRA能显著降低放射诱导的细胞G2/M期阻滞，下调SGC-7901细胞Bcl-2与survivin的mRNA表达(P<0.05)，上调Bax与NF-κB的mRNA表达(P<0.05)。结论: ATRA能够增加胃癌细胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性，可能与抑制细胞周期G2/M期的阻滞作用、下调Bcl-2与survivin mRNA表达和上调NF-κB与Bax mRNA表达有关。

全反式维甲酸； 放射治疗； 胃癌细胞SGC-7901； 敏感性

胃癌是常见来源于胃黏膜上皮细胞的消化道恶性肿瘤。胃癌在全球范围内常见的恶性肿瘤中排第4位，死亡率占所有恶性肿瘤的第2位[1]。在中国，胃癌的发病率很高，仅次于肺癌与肝癌，其中男性发病率高于女性。临床数据表明，中国的胃癌患者确诊时大部分已进入III或IV期[2]，施行手术切除困难，获得根治的比例很少，因此，在确诊后进行放疗化疗是对胃癌进行综合性治疗的重要手段。然而，胃癌对放射治疗敏感性低，可能是由于胃癌细胞对射线的敏感性低以及邻近器官的耐受性低而致放射剂量受到限制，导致无法获得理想的治疗效果。

全反式维甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)作为维生素A的主要代谢产物，主要参与调控细胞的增殖分化，具有诱导肿瘤细胞分化为成熟细胞或恶性逆转，促进细胞凋亡，抗肿瘤血管生成，达到抑制肿瘤恶化的作用，是一种诱导分化剂[3-5]。全反式维甲酸对人胃癌BGC-823细胞的增殖具有抑制作用，与奥沙利铂具有协同作用；其作用机制可能与Bcl-2和survivin蛋白下调有关[6]。全反式维甲酸作用于胃癌SGC-7901细胞72 h后，显著抑制PPARγ的表达[7]。另外，全反式维甲酸通过下调survivin蛋白和增强caspase活性，诱导胃癌细胞MKN-45的凋亡[8]。对204例中晚期胃癌患者，采用全反式维甲酸联合化疗[9]，发现患者的近期疗效好，生存期延长。但是，由全反式维甲酸引起的不良反应增加。本实验拟用全反式维甲酸联合放射治疗对SGC-7901细胞的作用进行研究，并进一步探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901(江西省肿瘤医院组织工程研究所)；胎牛血清和DMEM培养基(Gibco)，MTT试剂和全反式维甲酸(Sigma)；青霉素和链霉素(华北制药股份有限公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)(上海生工生物工程有限公司)； RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)； Bax、Bcl-2、survivin与NF-κB引物设计与合成(上海生工生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 将人胃癌细胞株SGC-7901置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素与链霉素的DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2、99%饱和湿度的培养箱中培养，待细胞基本铺满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化，换新鲜培养基，轻轻吹打至单细胞悬液，传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 MTT法检测ATRA对SGC-7901细胞存活率的影响 收集处于对数增殖期的SGC-7901细胞，调整细胞为2×107/L，加于96孔板中，每孔100 μL，培养贴壁后，分别加入终浓度为1、2、4、8和16 μmol/L的ATRA，置于37 ℃、5% CO2、99%饱和湿度的培养箱中培养24 h，换100 μL新鲜培养基，加入20 μL MTT试剂(5 g/L)，继续培养4 h，弃去MTT培养液，加入100 μL DMSO终止反应，于570 nm处采用酶联免疫检测仪(Bio-Rad)检测吸光度(A)，细胞活力抑制率=(1-A药物组)/A正常对照组×100%，设空白调零孔和正常对照组，每组6个复孔。

2.3 克隆形成实验 收集处于对数生长期的SGC-7901细胞，消化制成单细胞悬液，待细胞贴壁，实验分2组：放射(radidation，Rad)组：给予不同剂量X射线照射；联合(combination，Com)组：8 μmol/L ATRA处理24 h，再给予不同剂量X射线照射。照射剂量分别为0、2、4、6和8 Gy，将细胞悬液稀释为以下浓度：0 Gy组为每孔250个细胞；2 Gy组为每孔500个细胞，4 Gy组为每孔1 000个细胞，6 Gy组为每孔2 000个细胞和8 Gy组为每孔4 000个细胞。将培养板置于照射野(20 cm×20 cm)内，距射野边缘为3 cm，用直线加速器6 MV的X线照射，源皮距(source-to-skin distance,SSD)为100 cm，剂量率为300 cGy/min。照射后，更换无药培养液继续培养14 d。用无水乙醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数克隆数。细胞存活曲线依据靶单击型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N拟合；克隆形成率(plating efficiency，PE)=克隆数/细胞数×100%；细胞存活分数(surviving fraction，SF)=照射剂量的克隆数/(细胞接种数×未照射克隆形成率)，并计算放射敏感性参数D0、Dq及N值。

2.4 流式细胞术检测各组细胞的细胞周期 收集处于对数增殖期的SGC-7901细胞，实验分4组：空白对照(control)组、ATRA组、6Gy组和ATRA+6Gy组，经相应处理后更换无药培养液，置于37 ℃、5% CO2、99%饱和湿度的培养箱中培养24 h，0.25%胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，加入PI染色，采用FC500流式细胞仪(Beckman Coulter)检测细胞周期。

2.5 实时荧光定量PCR 依据2.4项分组，按照TRIzol说明书提取总RNA，反转录合成cDNA(引物序列见表1)，进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃ 7 min；95 ℃ 15s、60 ℃ 60 s，40个循环；63 ℃ 5 min。所得结果于AB7500荧光定量操作系统(Life Technologies)进行分析，采用2-ΔΔCt法对结果进行计算。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件对所有实验数据进行分析，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间数据比较采用单因素方差分析，任意两组数据间比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 qPCR引物序列

结 果

1 ATRA对SGC-7901细胞存活率的影响

随着ATRA浓度的升高，SGC-7901细胞的存活率逐渐下降；当ATRA浓度增加至8 μmol/L时，细胞存活率降至最低值(图1)，后续实验均采用8 μmol/L 的ATRA进行。

Figure 1. The inhibitory effect of ATRA at different concentrations on the viability of the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

图1 不同浓度ATRA对SGC-7901细胞生长的抑制作用

2 平板克隆形成实验测定SGC-7901细胞的放射敏感性

与放射组相比，在各照射剂量下联合组的存活分数降低，并有生存曲线的整体下移，见图2、表2。

Figure 2.The effect of ATRA on the radiosensitivity of SGC-7901 cells. Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRad group.

图2 ATRA对SGC-7901细胞放射敏感性的影响

表2 SGC-7901细胞照射后存活曲线的相关参数

Com: combination (ATRA+X-ray radiotherapy); Rad: X-ray radiotherapy alone.*P<0.05vsRad group.

3 各组SGC-7901细胞周期的变化

与对照组相比，ATRA组、6 Gy组和ATRA+6 Gy组的细胞周期G2/M期的比例显著增加(P<0.05)，6 Gy组中G2/M期的所占比例最大，其中ATRA+6 Gy组G2/M期的所占比例显著低于6 Gy组(P<0.05)，见图3。

Figure 3. The change of cell cycle in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs6 Gy group.

图3 各组SGC-7901细胞周期的变化

4 SGC-7901细胞中Bax、Bcl-2、survivin与NF-κB mRNA表达的变化

与对照组相比，ATRA组、6 Gy组和ATRA+6 Gy组Bcl-2与survivin的mRNA表达显著下降(P<0.05)，Bax与NF-κB的mRNA表达显著上升(P<0.05)；其中ATRA+6 Gy组的变化幅度显著大于ATRA组和6 Gy组，见图4。

讨 论

放射治疗是一种局部或区域治疗的手段，临床适应范围更广，对于晚期患者选择合理的放疗可获得良好的姑息性治疗效果。但由于临床胃癌晚期患者放疗的治疗效果差，复发率高，并出现远处转移，为了提高放疗的疗效，提高肿瘤细胞对射线的敏感性具有非常重要的意义。为此，本实验对全反式维甲酸胃癌细胞SGC-7901的放射敏感性及其相关机制进行了初步研究。

随着全反式维甲酸浓度增加，对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用越显著，并与8 μmol/L时达到最大值。克隆形成实验结果表明，联合组的D0、Dq及N值均低于单纯照射组，且其存活曲线整体下移。提示，联合细胞的亚致死损伤修复能力降低，全反式维甲酸在一定程度上提高了细胞的放射敏感性。大量研究数据表明，细胞的放射敏感性随细胞周期时相的变化而改变。肿瘤细胞进入G2期与M期时，放射敏感性会增高。当肿瘤细胞受到射线照射引起DNA损伤后，细胞周期会出现阻滞于G1/S期或G2/M期，进行DNA损伤的修复[10]，未能成功修复则启动凋亡信号使细胞产生凋亡[11]。同时给予全反式维甲酸与放射处理后，SGC-7901细胞的G2/M期阻滞时间相对于给予单纯放射时缩短，推测全反式维甲酸破坏肿瘤细胞DNA损伤修复过程，导致肿瘤细胞凋亡增加，从而增加肿瘤细胞的放射敏感性。

Figure 4.The mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the SGC-7901 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 SGC-7901细胞中Bax、Bcl-2、survivin与NF-κB的mRNA表达

NF-κB是肿瘤细胞中广泛表达的转录因子，普遍认为肿瘤细胞的放射抵抗性与NF-κB的激活有关，激活NF-κB可以增强肿瘤细胞的放射敏感性，特定条件下发挥促凋亡作用[12]。给予全反式维甲酸联合放射处理后，SGC-7901细胞中NF-κB的mRNA表达显著上升，提示全反式维甲酸增加SGC-7901细胞的放射敏感性可能与NF-κB的激活有关。Survivin是凋亡抑制蛋白的成员之一，具有调控细胞周期，促进血管生成的作用，与肿瘤细胞的放射敏感性有密切关系[13]。NF-κB上调抗凋亡蛋白Bcl-2，进一步下调IκBα的表达，从而增强NF-κB的活化，形成一个正反馈循环。Bcl-2与Bax是一对凋亡调控相关蛋白，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。研究发现，当给予全反式维甲酸联合放射处理后， Bcl-2与survivin的mRNA表达明显下降，Bax的mRNA表达明显上升。综上所述，全反式维甲酸具有提高胃癌细胞SGC-7901的放射敏感性，并促进肿瘤细胞的凋亡，其作用机制可能与下调Bcl-2与survivin mRNA表达以及上调NF-κB与Bax mRNA表达有关。

本文首次采用全反式维甲酸联合X射线治疗，对胃癌细胞的放射敏感性进行研究。与传统单独采用放射治疗相比，发现全反式维甲酸确实能提高放射治疗的疗效。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effects of all-transretinoic acid on sensitivity of gastric cancer cells to radiotherapy

WANG Yan-ping1, ZHAO Xian-qun1, ZHANG Xiang-dong1, XU Wei2, XIANG Xiao-hui2

(1DepartmentofGastroenterology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China;2CenterofHepatobiliary,Pan-creaticandSplenicDiseases,AffiliatedHospitalofLogisticalCollege,CPLA,Tianjin300162,China.E-mail:docnany@126.com)

AIM: To investigate the effect of all-transretinoic acid (ATRA) on the viability of gastric cancer cell SGC-7901 and the sensitivity to radiotherapy. METHODS: MTT assay was used to examine the cell viability. Radio-sensitivity and cell cycle were determined by colony formation assay and flow cytometry, respectively. The mRNA levels of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB in the cells were measured by RT-qPCR. RESULTS: ATRA inhibited the viability of SGC-7901 cells in a concentration-dependent manner. The maximal inhibition was at concentration of 8 μmol/L. Colony formation assay revealed that the combination of ATRA with X-ray treatment significantly reduced the values of D0 and Dq, and shifted down the fitting survival curve, as compared with radiotherapy alone. Moreover, ATAR markedly decreased the percentage of G2/M phase in the SGC-7901 cells (P<0.05). In addition, following ATRA treatment, the mRNA levels of Bcl-2 and survivin were decreased (P<0.05), whereas the mRNA levels of Bax and NF-κB were increased (P<0.05). CONCLUSION: ATRA enhances the sensitivity of SGC-7901 cells to radiotherapy, inhibits G2/M arrest and regulates the mRNA expression of Bax, Bcl-2, survivin and NF-κB.

All-transretinoic acid; Radiotherapy; Gastric cancer cell SGC-7901; Sensitivity

1000- 4718(2016)08- 1440- 05

2016- 04- 07

2016- 06- 28

国家自然科学基金青年项目(No. 81500489)

R811.5; R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.017

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0377-63200161； E-mail： docnany@126.com