H2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放*

马 洁， 王娇娇， 王 璐， 李新娟， 王国红， 赵红岗， 李东亮△

(1新乡市中心医院神经内科， 2新乡医学院生理学与神经生物学教研室，河南 新乡 453003)

H2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放*

马 洁1， 王娇娇2， 王 璐2， 李新娟2， 王国红2， 赵红岗2， 李东亮2△

(1新乡市中心医院神经内科，2新乡医学院生理学与神经生物学教研室，河南 新乡 453003)

目的： 观察硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)对三磷酸腺苷(ATP)损伤的大鼠小胶质细胞通透性、胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)及IL-1β释放的影响，探讨H2S 对ATP-P2X嘌呤信号通路的作用及其神经保护的分子机制。方法: 取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞用于实验。Fura-2/AM 荧光染料检测各组[Ca2+]i，细胞内YO-PRO-1荧光强度检测以反映膜的通透性，ELISA检测ATP-细菌脂多糖(LPS)激活的大鼠小胶质细胞IL-1β的释放水平。结果: 随着ATP浓度的增加，大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加，而给予NaHS预处理后细胞膜通透性明显降低，对YO-PRO-1的摄取明显减少(P<0.05)，胞内荧光强度明显减弱(P<0.05)。ATP处理大鼠小胶质细胞引起[Ca2+]i迅速升高后缓慢下降形成持续时间较长的平台期。NaHS预处理虽不能改变[Ca2+]i的峰值，但可抑制平台期的形成(P<0.05)。ATP与LPS联合作用可促进大鼠小胶质细胞IL-1β的生成和分泌，而NaHS预处理可明显逆转这一效应(P<0.05)。结论: NaHS可降低ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜通透性、Ca2+内流和IL-1β释放，抑制该细胞的激活，提示嘌呤信号通路可能介导H2S的细胞保护作用。

三磷酸腺苷； 嘌呤能P2X受体； 硫化氢； 小胶质细胞

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是体内重要的能量分子及嘌呤神经递质，可激活P2X受体调节大脑功能，并使神经元去极化，激活细胞膜离子通道，调节突触间传递，在维持神经元正常生理活动中起着重要作用。生理浓度的ATP作用于离子型P2X受体(如P2X1-4及P2X7亚基)可使膜阳离子通道迅速开放，进一步促使细胞膜去极化。而高浓度ATP持续或反复地刺激P2X受体(如P2X4和P2X7)可使其构象发生改变，并使其形成可通透NMDG+、YO-PRO-1、溴化乙啶等大分子物质的大膜孔[1]，进而诱导细胞凋亡与坏死。目前有关ATP-P2X嘌呤信号通路对神经退行性疾病的文献报道提示，ATP与LPS联合作用可激活小胶质细胞并促使其释放IL-1β，用P2X7受体拮抗剂可抑制其释放，表明P2X7受体的激活对小胶质细胞活化及IL-1β释放起着重要作用[2-3]。

研究发现大鼠脑内含有较高浓度的H2S(50～160 μmol/L)，从而引起了人们对H2S“神经调质”及“神经保护剂”的种种猜想[4]。此后的研究观察发现H2S不但可调节脑血管紧张度，促进学习记忆，调节神经元和胶质细胞Ca2+和pH稳态[5]，而且在脑卒中、外伤、神经系统退行性疾病中均具有重要的神经保护作用。目前ATP-P2X嘌呤信号通路在H2S脑神经保护中的作用鲜有研究报道。本实验以ATP致伤的大鼠小胶质细胞为模型，并联合LPS处理，探讨ATP与P2X受体在小胶质细胞激活及促发炎症反应中的机制，试图明确嘌呤信号通路在H2S神经保护中的作用。

材 料 和 方 法

1 细胞系和主要试剂

大鼠小胶质细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

ATP、NaHS和DMEM培养基均购自Sigma；YO-PRO-1 iodide购自Invitrogen；Fura-2/AM购自Dojindo；大鼠IL-1β ELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司；胎牛血清购自HyClone。

2 方法

2.1 母液及工作液配制 ATP和NaHS分别用无菌三蒸水配成500 mmol/L和50 mmol/L的母液，分装后避光于-20 ℃保存，在使用前ATP分别配成0.3 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L的工作液，NaHS配成200 μmol/L的工作液。

2.2 细胞培养及实验分组 大鼠小胶质细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。实验取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞，随机分为正常对照组(DMEM培养基常规培养)、ATP组(接种细胞24 h后给予ATP处理)和NaHS+ATP组(NaHS孵育30 min后给予ATP处理)。

2.3 YO-PRO-1摄入及膜孔开放的检测 荧光染料YO-PRO-1的分子量为629 D，当细胞膜孔开放时可进入细胞并与核酸结合发出绿光，其荧光强度反映膜孔开放的程度。将YO-PRO-1与不同浓度的ATP同时加入各组，每组YO-PRO-1溶液的终浓度为2 μmol/L。37 ℃孵育1 h后使用多功能酶标仪检测(激发波长485 nm，发射波长516 nm)。YO-PRO-1荧光强度(%)=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。本实验将对照组细胞摄取的荧光强度定为100%。

2.4 [Ca2+]i的测定 取对数期生长的细胞，以2×105/L的细胞密度接种于直径为35 mm的培养皿中，24 h后各组细胞按分组的描述进行处理。5 μmol/L Fura-2/AM孵育30 min后常规洗涤，HBSS孵育30 min，使用具有Ca2+成像系统的荧光显微镜检测ATP引起的[Ca2+]i变化，[Ca2+]i以340 nm荧光强度与380 nm荧光强度的比值(F340/F380)来计算。

2.5 ELISA检测细胞培养液中IL-1β的水平 取对数期生长的细胞均匀地接种于60 mm的培养皿中，随机分为5组：正常对照组、ATP组、LPS组、ATP+LPS组和NaHS+ATP+LPS组。正常对照组使用DMEM培养基常规培养； ATP组给予3 mmol/L ATP处理3 h；LPS组给予1 mg/L LPS处理12 h；ATP+LPS组先加入LPS处理9 h后再加入ATP，使LPS与ATP再共同作用3 h；NaHS+ATP+LPS组首先给予200 μmol/L NaHS预孵育30 min，其余处理同ATP+LPS组。收集细胞上清液，离心后，依照试剂盒说明书操作，检测各组细胞培养上清液内IL-1β水平。

3 统计学处理

数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行处理。多组间显著性检验用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成的影响

分别给予不同浓度的ATP作用大鼠小胶质细胞1 h，酶标仪检测各组细胞内YO-PRO-1荧光强度，结果显示 0.3 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L和10 mmol/L ATP作用后荧光强度分别为100.31%、107.86%、112.96%、143.17%和151.82%，即各组荧光强度随ATP浓度的增加而增强，其中3 mmol/L、5 mmol/L及10 mmol/L ATP组细胞内荧光强度与正常对照组相比差异均有统计学显著性(P<0.01)，提示上述条件下细胞膜的通透性显著增加。

使用NaHS预孵育后，再给予3 mmol/L ATP可见细胞内荧光强度为101.17%，明显低于ATP处理组(P<0.01)，与正常对照组比较差异无统计学显著性，说明NaHS能明显抑制ATP诱导的膜孔形成，见图1。

Figure 1.The effect of NaHS on YO-PRO-1 uptake induced by ATP in the rat microglia. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsATP group.

图1 NaHS对ATP诱导的细胞通透性的影响

2 NaHS对ATP诱导的[Ca2+]i的影响

用3 mmol/L ATP处理，大鼠小胶质细胞[Ca2+]i迅速升高，[Ca2+]i峰值可增加20.8%，随之[Ca2+]i下降，但并不能降至基础值，而是长时间维持在一个持续、平稳的平台期。我们观察大鼠小胶质细胞 [Ca2+]i达到峰值后500 s内的变化，以每100 s内[Ca2+]i变化的平均值计算，发现大鼠小胶质细胞[Ca2+]i仍分别维持在18.3%、16.3%、12.8%、10.6%和10.5%的增幅。但在胞外无钙条件下，3 mmol/L ATP虽仍可使[Ca2+]i峰值增加18.7%，与有钙条件下差异无统计学显著性。比较两组峰100 s后的变化，无钙组[Ca2+]i的增幅迅速下降，两组差异有统计学显著性(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The effect of ATP on [Ca2+]iof rat microglia. Mean±SEM.n=20.

图2 ATP对大鼠小胶质细胞[Ca2+]i的影响

给予NaHS处理大鼠小胶质细胞30 min后再加入3 mmol/L ATP，[Ca2+]i的峰值可增加21.7%，与ATP组相比差异无统计学显著性，但在出现峰值的200 s后NaHS+ATP组[Ca2+]i增幅显著低于ATP组(P<0.01)，可见NaHS对ATP诱导的胞外Ca2+内流有明显的抑制作用，见图3。

3 NaHS抑制ATP-LPS诱导的大鼠小胶质细胞IL-1β的分泌

检测细胞上清液内IL-1β水平来反映大鼠小胶质细胞的激活，结果发现单纯ATP处理组或LPS处理组细胞上清液内IL-1β水平与对照组相比差异均无统计学显著性。而ATP+LPS组无论与单纯ATP处理组相比还是与LPS处理组相比，IL-1β水平均明显升高(P<0.05)。但在ATP+LPS处理前30 min加入NaHS，则细胞上清液的IL-1β水平则明显降低(P<0.05)，见图4。

Figure 3.The inhibitory effect of NaHS on ATP(3 mmol/L)-induced increase in [Ca2+]iin rat microglia. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vsATP group.

图3 NaHS抑制ATP介导的大鼠小胶质细胞[Ca2+]i的升高

讨 论

有文献显示脑外伤后大鼠脑内微透析液内ATP与谷氨酸含量明显增多[6]。Noda等[7]指出由损伤部位释放的危险信号分子(如ATP)是激活小胶质细胞并诱导其向损伤部位迁移的重要因素。本文用高浓度ATP处理培养的大鼠小胶质细胞，模拟体内缺氧、缺血时损伤部位释放大量ATP对小胶质细胞的影响，并证实了外源性H2S可以明显地抑制ATP-P2X嘌呤信号途径相关的细胞通透性增加、钙内流及IL-1β的释放。

Figure 4.The effect of NaHS on ATP and LPS-induced IL-1β release in the rat microglia. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsATP+LPS group.

图4 NaHS对ATP及LPS诱发的大鼠小胶质细胞IL-1β释放的影响

高浓度ATP反复或持续的刺激小胶质细胞后，小胶质细胞被激活，其表面的P2X受体(如P2X4和P2X7)不但表达上调[8]，其通透性也明显增大，形成可通透900 D以下有机分子的大膜孔[9]。由图1看出随ATP浓度增加，细胞对YO-PRO-1的摄取也逐渐增加，具有浓度依赖性。这与我们前期在PC12细胞上的结果一致[9]，即高浓度ATP会加速细胞膜孔的形成，增加膜通透性。NaHS预孵育30 min后加入ATP处理1 h，培养的大鼠小胶质细胞内的YO-PRO-1荧光强度明显降低，表明NaHS能明显抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成，降低细胞膜通透性，提示ATP-P2X嘌呤途径在NaHS抑制膜孔形成方面有重要作用，P2X受体可能是重要的分子靶标。

本实验室前期在PC12细胞上的实验发现，ATP诱导的细胞通透性形成及钙内流都与ATP-P2X嘌呤信号通路(尤其是P2X受体的激活)有着密切的联系[9]。高浓度的ATP可激活小胶质细胞，介导了P2X受体相关的Ca2+通透性增加及Ca2+内流， 且Ca2+内流对细胞内炎性介质的产生释放有着重要的调节作用[10]。Sharma等[11]也从病理生理学功能指出Ca2+的稳态与小胶质细胞功能有着紧密的联系，Ca2+内流在小胶质细胞激活后的迁移过程中发挥着重要的作用，破坏Ca2+稳态可诱发中枢神经系统紊乱。本研究发现，用ATP处理培养的大鼠小胶质细胞，其[Ca2+]i迅速出现瞬时性升高，而后缓慢下降，形成一个持续时间较长、相对稳定的平台期，[Ca2+]i维持在高水平，较长时间回不到基础值。Hide等[12]认为在大鼠小胶质细胞中，ATP诱导[Ca2+]i形成的平台期与P2X受体的激活有关。而在胞外无钙条件下，重复上述实验，我们发现ATP虽也可引起[Ca2+]i的短暂性升高，但[Ca2+]i达顶峰后会迅速下降至加药前的基础值。Takenouchi等[13]在无钙环境下给予ATP，[Ca2+]i同样不能维持在高水平的平台期，重新给予CaCl2，上述现象再次恢复。这些结果验证了ATP激活小胶质细胞引起 [Ca2+]i相对稳定的平台期主要与胞外Ca2+内流有关，是激活离子型P2X受体的结果。

给予ATP前用NaHS预孵育大鼠小胶质细胞，结果发现NaHS并不能改变ATP诱导的[Ca2+]i瞬时性升高，但可使ATP诱导的[Ca2+]i峰值后的平台快速下降，与ATP组中[Ca2+]i在高水平状态维持形成鲜明对照。NaHS拮抗了ATP诱导的[Ca2+]i高水平维持，提示NaHS可抑制P2X受体激活，减少胞外Ca2+内流，减轻胞内Ca2+超载和细胞损伤，具有细胞保护作用。

大量证据显示，ATP是促进LPS处理后小胶质细胞和巨噬细胞中IL-1β成熟与分泌的重要内源性刺激物，在P2X家族中，P2X7受体的激活对IL-1β的成熟和释放起着重要的作用[14]。P2X7受体也被认为是脑损伤后调节炎症反应及推动IL-1β释放的关键靶分子。Gicquel等[15]的实验证实LPS处理可以促进IL-1β前体的积聚，而刺激P2X7受体则增加IL-1β释放。Shiratori等[16]也在实验中证实刺激P2X7受体能促进类胶质细胞或大鼠小胶质细胞释放IL-1β、CCL3、TNF-α及CXCL2。这些实验都显示了ATP-P2X嘌呤信号通路对IL-1β成熟与释放的重要性。

本文ELISA实验结果表明：给予ATP或LPS均不能引起大鼠小胶质细胞IL-1β的释放，与对照组相比无显著差异，但先给予LPS后再用ATP处理，大鼠小胶质细胞IL-1β的释放显著增加，这与上述的实验结果完全一致，提示在大鼠小胶质细胞中，LPS的刺激可能同样只会引起胞内pro-IL-1β的增多和积聚，当“危险信号分子”ATP加入后，激活P2X受体，尤其是P2X7受体才能促进细胞释放成熟的IL-1β。但由LPS和ATP联合作用引起的IL-1β释放显著增加的现象又可因预先使用NaHS孵育而消除，提示NaHS可抑制ATP-LPS引起的大鼠小胶质细胞IL-1β的释放，其机制可能与NaHS抑制了P2X7受体的激活有关。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Hydrogen sulfide inhibits adenosine triphosphate-induced activation and IL-1β releases in rat microglia

MA Jie1, WANG Jiao-jiao2, WANG Lu2, LI Xin-juan2, WANG Guo-hong2,ZHAO Hong-gang2, LI Dong-liang2

(1DepartmentofNeurology,TheCentralHospitalofXinxiang,2DepartmentofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:xyldl8@126.com)

AIM: To investigate the effects of sodium hydrosulfide (NaHS), a donor of hydrogen sulfide (H2S), on the membrane permeability, intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) and the release of IL-1β induced by adenosine triphosphate (ATP) in rat microglia, and to explore the effect of H2S on ATP-P2X purinergic signaling pathway and the molecular mechanism of its neuroprotective effect. METHODS: Rat microglia in logarithmic growth phase were used in the study. The [Ca2+]iwas detected by Fura-2/AM staining. Fluorescent dye YO-PRO-1 was used to observe the membrane permeability. Interleukin-1β (IL-1β) was measured by rat IL-1β ELISA kits. RESULTS: The YO-PRO-1 fluorescence intensity was obviously elevated by ATP induction in a dose-dependent manner in the rat microglia, but this effect was counteracted by NaHS pretreatment (P<0.05). [Ca2+]irapidly increased and then decreased slowly, forming a stable platform for a long time when rat microglia were treated with ATP. Ca2+spike activity induced by ATP had no change, but the platform disappeared (P<0.05) after NaHS pretreatment. The ATP and LPS together facilitated the release of IL-1β, but the phenomenon was inhibited by NaHS (P<0.05). CONCLUSION: Hydrogen sulfide may decrease the membrane permeability, calcium inflow and IL-1β release in rat microglia activated by high dose of ATP. The cytoprotection of hydrogen sulfide may be mediated by purinergic signaling pathway.

Adenosine triphosphate; Purinergic P2X receptors; Hydrogen sulfide; Microglia

1000- 4718(2016)08- 1408- 05

2015- 10- 20

2016- 06- 07

国家自然科学基金资助项目(No. 81271376)；河南省高校重点科研项目(No. 15A310009)；新乡医学院重点领域开放课题 (No. ZD2011-2)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.011

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0373-3029104； E-mail： xyldl8@126.com