非诺贝特对实验性糖尿病大鼠早期视网膜病变的影响

关清华，旷劲松，赵玉蓉，程　岚，张秀彬

(辽宁省沈阳市第四人民医院，辽宁 沈阳110031)



非诺贝特对实验性糖尿病大鼠早期视网膜病变的影响

关清华，旷劲松，赵玉蓉，程岚，张秀彬

(辽宁省沈阳市第四人民医院，辽宁 沈阳110031)

[摘要]目的观察非诺贝特对早期糖尿病性视网膜病变(DR)大鼠视网膜组织血管内皮生长因子(VEGF)、蛋白激酶C(PKC)表达及细胞凋亡的影响,探讨非诺贝特防治早期DR的作用机制。方法将实验用封闭群4周雄性健康SD大鼠50只随机分成正常组(10只)、糖尿病组(20只)和非诺贝特组(20只)。非诺贝特组和糖尿病组均采用链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射制作糖尿病模型。非诺贝特组每天给予非诺贝特10 mg/kg与饲料混合后喂养，糖尿病组与正常组给予普通饲料喂养。记录给药前及给药4，8，12，16周时3组空腹血糖水平。给药16周后处死大鼠，取眼球，制作视网膜组织切片，采用免疫组织化学染色法检测VEGF和PKC蛋白表达情况，采用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡情况。结果给药4，8，12，16周非诺贝特组和糖尿病组空腹血糖水平均显著高于正常组(P均<0.05)，但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药16周后3组大鼠视网膜VEGF和PKC蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，其中糖尿病组与非诺贝特组大鼠VEGF和PKC蛋白表达水平较正常组明显上调(P均<0.05)，但非诺贝特组较糖尿病组明显降低(P均<0.05)。非诺贝特组及糖尿病组视网膜组织细胞凋亡指数均明显高于正常组(P均<0.05)，但非诺贝特组视网膜组织细胞凋亡指数显著低于糖尿病组(P<0.05)。结论非诺贝特可下调早期糖尿病大鼠视网膜组织中VEGF和PKC表达，减少视网膜组织细胞凋亡，干预早期DR的发生发展。

[关键词]糖尿病视网膜病变；非诺贝特；血管内皮生长因子；蛋白激酶C；细胞凋亡

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是成人致盲的主要原因，严重影响患者的生活质量，其患病率随着糖尿病病程的延长而增高。从糖尿病发病开始20年内，几乎所用的1型糖尿病和60%的2型糖尿病都将发展成不同程度的DR[1]。近年来，随着糖尿病发病率逐渐增高，预计DR发生率将进一步升高。故采取有效方式延缓和治疗DR具有重要意义。非诺贝特是PPAR-α受体激动剂，除可调节血脂水平外，有循证医学表明其能延缓DR进展，可能起到某种特殊作用[1]。本研究观察了非诺贝特对早期DR大鼠视网膜组织血管内皮生长因子(VEGF)和蛋白激酶C(PKC)蛋白表达的影响，旨在探讨非诺贝特防治早期DR的作用机制，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物及造模实验用封闭群雄性健康Sprague-Dawley (SD)大鼠50只，鼠龄约4周，体质量80～100 g，中国医科大学动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2013-0001。随机分成正常组(10只)、糖尿病组(20只)和非诺贝特组(20只)。非诺贝特组和糖尿病组均采用STZ (60 mg/kg, 0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.0)一次性腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，正常组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。3 d后，正常组大鼠空腹血糖均小于5.6 mmol/L，非诺贝特组和糖尿病组各有18只大鼠成模(空腹血糖大于17 mmol/L)。实验期间各组大鼠自由饮水、摄食混合饲料，非诺贝特组每天给予非诺贝特10 mg/kg与饲料混合后喂养，每4周测1次血糖。其中3只糖尿病模型大鼠于饲养期间死亡，非诺贝特组剩余17只，糖尿病组剩余16只。

1.2眼球标本制作饲养3个月后，过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，立即摘除眼球，于4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液中固定，48 h后流水冲洗,梯度乙醇脱水，在体积分数80%乙醇脱水阶段，切除眼前节；常规包埋， 4 μm连续切片，每只眼球取10个面，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片，行HE染色及免疫组织化学检测。

1.3免疫组织化学检测VEGF和PKC蛋白表达染色步骤按免疫组织化学试剂盒说明书进行，采用SP法，DAB显色，苏木素复染。光镜下观察，以胞质中出现棕黄色或黄色颗粒为阳性，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用Biosens Digital Imaging System V1.6高清晰度系统病理图文分析系统对结果进行半定量分析。每个眼球随机选取3张切片，每张切片在400倍镜下随机选取3个视野，统计选定的图像所用的阳性信号的光密度值，取平均值。

1.4TUNEL染色法检测视网膜细胞凋亡情况将取出的新鲜视网膜组织用0.9%的NaCl溶液冲洗干净后浸泡于10%的多聚甲醛中，石蜡包埋后制成石蜡切片，按免疫组织化学试剂盒说明进行操作，封片后在显微镜下进行观察。使用Image-Pro-Plus 6.0图文分析系统对图像进行半定量分析，并观察其表达部位。

1.5统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。建模后不同时期3组大鼠空腹血糖的比较采用重复测量数据的方差分析，3组大鼠视网膜组织VEGF、PKC蛋白表达水平及神经节细胞层凋亡细胞数的比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.13组大鼠全身情况及血糖水平正常组大鼠毛色白而有光泽，体质量逐月增加，活动灵敏，生长迅速。糖尿病组大鼠出现多尿、多饮、多食及体质量减轻，毛色变黄，活动减少。非诺贝特组大鼠全身症状加重程度较糖尿病组轻微。给药4，8，12，16周时非诺贝特组和糖尿病组空腹血糖水平均显著高于正常组(P均<0.05)，但2组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.23组大鼠视网膜组织HE染色结果光镜下正常组视网膜结构层次清晰，排列有序；糖尿病组及非诺贝特组各层结构疏松，细胞间距增大，数目减少，内核层萎缩消失，神经纤维层变薄，糖尿病组表现更为明显。见图1～3。

表1　3组大鼠不同时期空腹血糖水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05。

2.33组大鼠视网膜组织中VEGF和PKC蛋白表达及其细胞凋亡指数比较糖尿病组与非诺贝特组大鼠VEGF和PKC蛋白表达水平均明显高于正常组(P均<0.05)，但非诺贝特组水平明显低于糖尿病组(P均<0.05)。见表2。

图1　正常组大鼠视网膜组织HE染色表现(SP，×400)

图2　非诺贝特组大鼠视网膜组织HE染色表现(SP，×400)

图3　DM组大鼠视网膜组织HE染色表现(SP×400)

组别nVEGFPKC细胞凋亡指数/%正常组1064.19±7.6540.18±5.670.78±0.14非诺贝特组1779.44±4.61①②90.23±4.80①②3.54±0.43①②糖尿病组16112.36±9.72①123.17±11.09①4.32±0.67①F69.75147.2573.31P<0.05<0.05<0.05

注：①与正常组比较，P<0.05；②与糖尿病组比较，P<0.05。

2.43组大鼠视网膜组织细胞凋亡情况正常组大鼠视网膜几乎未检测到凋亡细胞，而非诺贝特组和糖尿病组均可见明显细胞凋亡，非诺贝特组细胞凋亡情况较糖尿病组轻微。见图4～6。

图4　正常组大鼠视网膜组织细胞凋亡情况(SP，×400)

3讨论

DR作为一种渐进性疾病，可导致不可逆性失明，其发生发展是一个复杂的过程，发病机制尚未完全明了。近年来，对DR发生发展的分子机制有了进一步理解，一般认为VEGF是DR早期病理机制中最为重要和关键性的一种细胞因子，其是非增殖性视网膜病变的潜在调控因子，同时是增殖性视网膜病变的主要启动因子，视网膜组织中VEGF的表达受PKC调控[2-3]。在DR中，VEGF有2个主要的病理生理功能[4]：①VEGF影响了内皮细胞的紧密连接，增加了毛细血管的渗透性，从而引起了液体外渗和视网膜水肿；②VEGF引起视网膜毛细血管中白细胞聚集，导致局部炎症因子的产生和炎症细胞通过内皮细胞的迁移，这些都能促进血-视网膜屏障的破坏，导致视网膜功能失调，可引起严重的视力损害。DR早期病理改变是基底膜增厚，通透性过高和微动脉瘤形成。这些病理改变随之而来的是微血管的闭塞，导致视网膜缺血，诱导VEGF的释放，VEGF是引起内皮细胞增殖、迁移和血管形成的有效促有丝分裂剂，然而在糖尿病视网膜中这些新生血管脆性强，很容易破裂，从而进一步加重DR。PKC是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，最初发现用于维持大脑的长期记忆。高血糖通过多种途径诱导了二乙酰基甘油的产生，二乙酰基甘油是PKC的生理活化剂，在视网膜中PKC的激活似乎主要是PKC-β的激活。经典的PKC亚型(PKC-β)在视网膜VEGF表达上调中起到重要作用，参与紧密连接的破坏，增加了白细胞停滞，与VEGF协同作用参与了视网膜病变的发生发展。本实验结果显示糖尿病组视网膜组织VEGF和PKC蛋白表达水平高于正常组，与文献[5]报道相符。非诺贝特是临床常用的调脂药物之一，可降低血浆中三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平和载脂蛋白B水平，同时由于其使载脂蛋白AⅠ和Ⅱ过度表达，并抑制载脂蛋白CⅢ，故可升高高密度脂蛋白胆固醇水平。FIELD和ACCORD-眼睛研究发现非诺贝特对DR的发生发展的保护效应是不依赖血脂水平的，表明在2型糖尿病中非诺贝特对DR的进展可能起到特殊作用[1]。Lingam等[6]研究表明非诺贝特能抑制VEGF通路，改善视网膜毛细血管渗漏和白细胞停滞。NoonanE等[7]提出非诺贝特可改善炎症反应，通过抑制血管平滑肌细胞中白细胞介素-1水平而抑制白细胞介素-6表达，还抑制了内皮细胞中肿瘤坏死因子-α诱导的血管细胞黏附分子-1表达和C反应蛋白诱导的单核细胞趋化蛋白-1表达,具有明显抗炎作用。Wong等[8]指出非诺贝特具有抗氧化作用，它可增强超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性,减少过氧化物的产生，抑制了PKC信号传导通路的异常激活，从而减少VEGF的产生。Chen等[9]提出非诺贝特的有益效应可被特定PPAR-α拮抗药阻断,而且敲除过氧化物酶体增生物激活受体的DR动物模型中观察不到非诺贝特诱导的VEGF下调和视网膜毛细血管渗漏的减轻。可见，非诺贝特对DR的治疗效应依赖于眼组织中药物靶点的存在，同时证明了这种治疗效应通过PPAR-α依赖机制介导。本研究也观察到非诺贝特组视网膜组织VEGF和PKC蛋白表达水平低于糖尿病组，可以推测非诺贝特可以降低糖尿病视网膜组织中VEGF和PKC蛋白表达水平，从而延缓了DR的发生发展。

图5　非诺贝特组大鼠视网膜组织细胞凋亡情况(SP，×400)

图6　糖尿病组大鼠视网膜组织细胞凋亡情况(SP，×400)

本研究观察到正常组大鼠视网膜几乎未检测到细胞凋亡，而非诺贝特组和糖尿病组均可见明显细胞凋亡，非诺贝特组细胞凋亡情况较糖尿病组轻微；同时半定量分析表明非诺贝特组及糖尿病组细胞凋亡指数高于正常组，但非诺贝特组细胞凋亡指数低于糖尿病组，表明非诺贝特具有减少细胞凋亡作用。杨宏伟等[10]研究表明糖尿病大鼠细胞凋亡主要发生在内层视网膜, 最早于发病4 周时出现在视网膜神经节细胞,数量上呈时间信赖性, 逐渐出现在内核层的双极细胞、神经胶质细胞及血管内皮细胞、周细胞等；且细胞凋亡的发生远远早于视网膜血管的变化, 16周前诱导的糖尿病大鼠视网膜病变仍处于背景期, 已有凋亡机制的参与，从而导致视力损伤。非诺贝特具有延长视网膜内皮细胞存活及减少凋亡效应[7-11],本研究结果与此相符。非诺贝特减少细胞凋亡的效应很可能由于腺苷酸-活化蛋白激酶和内皮一氧化氮合酶的激活导致[7]。

此外，非诺贝特组视网膜组织VEGF和PKC蛋白表达水平仍高于正常组，可见非诺贝特不能完全逆转DR的发生发展，还有多种机制及因素参与DR的进展，仅靠降低视网膜组织VEGF和PKC蛋白表达来延缓DR的发展还远远不够，需要从多方面着手来延缓其发生发展，故应该继续研究及探讨。从本实验结论及既往大规模临床观察研究结果[12]考虑，糖尿病患者若无禁忌情况下应尽早应用非诺贝特，至少在发生增殖性视网膜病变之前即开始应用，从而更好地延缓DR的发生发展，应用非诺贝特与应用降糖及降压药物同等重要。

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Effects of fenofibrate on early retinopathy in rats with experimental diabetes

GUAN Qinghua, KUANG Jinsong, ZHAO Yurong, CHENG Lan, ZHANG Xiubin

(Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of fenofibrate on vascular endothelial growth factor (VEGF) and protein kinase C (PKC) expression and cell apoptosis in retinal tissue of rats with earlier diabetic retinopathy (DR), and explore the mechanism of fenofibrate for the prevention and treatment of early DR. Methods 50 male healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (10 cases), fenofibrate group (20 cases) and diabetes mellitus (DM) group (20 cases). The animals in fenofibrate group and DM group were injected streptozotocin (STZ) intraperitoneally once to set up DM model. Then the animals were fed with fenofibrate (10 mg/kg) and feed mixture in fenofibrate group and normal feed in DM group and normal control group. The blood-fasting glucose at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week were detected. After 16 weeks the rats were sacrificed and retinal tissue was obtained for immunohistochemical staining to detect the expression of VEGF and PKC, the apoptosis in retina was detected by TdT-dUTP terminal nick-end labeling (TUNEL) staining. Results The blood-fasting glucose levels of the fenofibrate group and DM group were significantly higher than that of the normal control group at the end of the 4th week, 8th week, 12th week and 16th week (all P<0.05), but there were no significant difference between the fenofibrate group and DM group (P>0.05). There were significant differences in the expressions of VEGF and PKC at the end of the 16th week among the three groups (all P<0.05), and which were significantly higher in the fenofibrate group and DM group than those in the normal control group (all P<0.05), but that of the fenofibrate group was lower than that of the DM group (P<0.05). The apoptosis index of fenofibrate group and DM group were higher than that of the normal control group (all P<0.05), but which of the fenofibrate group was significantly lower than that of the DM group (P<0.05). Conclusion Fenofibrate can down regulate the expression of VEGF and PKC in retinal tissue of earlier DM rats and reduce the apoptosis of retinal tissue, which may interfere in the development of earlier DR.

Key words:diabetic retinopathy; fenofibrate; vascular endothelial growth factor; protein kinase C; cell apoptosis

[收稿日期]2015-09-05

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)06-0578-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.003

[基金项目]沈阳市科技局课题(F11-262-9-25)

[作者简介]关清华，女，硕士，主治医师，主要从事糖尿病及其并发症的研究。[通信作者]旷劲松， E-mail：kjs_1965@163.com