广西鹅圆环病毒全基因组序列测定

曹慧慧 孙文超 郑敏 韦显凯 苏姣秀 蒙振亩 黄宝学 刘棋

摘要：【目的】解析鹅圆环病毒（Goose Circovirus，GoCV）广西流行毒株的全基因组序列及其遗传进化地位，掌握广西GoCV的流行情况，为今后更有效防控GoCV提供理论依据。【方法】分3段对阳性组织样品中的GoCV全基因组进行PCR扩增、克隆和测序，并对拼接得到的GoCV广西流行毒株全基因组进行核苷酸组成、基因组结构及遗传变异分析。【结果】GoCV广西流行毒株（GXTD254）全基因组长度为1822 nt，编码4个主要开放阅读框：ORF V1（Rep蛋白，293个氨基酸）、ORF V2（37个氨基酸）、ORF C1（Cap蛋白，250个氨基酸）和ORF C2（99个氨基酸），且Rep蛋白较Cap蛋白相对保守。遗传进化分析结果表明，GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分离毒株（ZJxs1）的遗传距离最接近，同属于一个遗传分支，但与我国台湾的大多数分离毒株（TW1021024G、TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW1020111GB）及另外2株浙江象山分离毒株（ZJxs3和ZJxs5）的遗传距离较远。【结论】目前我国流行的GoCV存在多个分支，广西流行毒株与部分浙江分离毒株在亲缘关系上比较接近。

关键词： 鹅圆环病毒；全基因组；序列分析；Rep蛋白；Cap蛋白

中图分类号： S858.33 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）01-0122-06

0 引言

【研究意义】鹅圆环病毒（Goose Circovirus，GoCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员，是无囊膜的二十面体病毒粒子，其直径约20 nm，为目前已知的最小鹅源病毒（竺春等，2007）。与猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）和鸭圆环病毒（Duck Circovirus，DuCV）等同属成员相似，GoCV也是一种潜在的免疫抑制病毒，主要侵害宿主的淋巴组织，导致宿主免疫抑制，生长迟缓，且增加继发感染的可能性，给鹅养殖业带来极大的经济损失（Chen et al.，2003）。因此，加强GoCV的相关研究对确保鹅养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】GoCV最早于1999年由德国学者从患病鹅的病变组织中分离获得（Soike et al.，2004），2001年Todd等首次克隆并測定了GoCV的全基因组序列。2003年，我国台湾学者Chen等对GoCV台湾分离毒株的全基因组进行扩增测序及同源性分析；余旭平等（2005）从因禽流感死亡的鹅体内检出GoCV，并对该流行毒株的基因组结构及流行病学情况进行分析，结果发现浙江永康株GoCV_yk01全长1821 bp，具有与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等圆环病毒共有的特征，与德国、我国台湾的流行毒株在全基因组水平有91%～93%的同源性，在Rep蛋白和外壳蛋白的氨基酸水平有94%～97%的同源性。此后，Scott等（2006）将间接免疫荧光检测方法应用于GoCV衣壳蛋白抗体检测；田敬等（2010）建立了针对GoCV的实时荧光定量PCR检测方法；徐雅萍等（2012）成功构建了GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆，且能通过转染鹅体内环化增殖出带标记的GoCV克隆。【本研究切入点】目前，国内有关GoCV的研究相对较少，尤其是广西，针对该病毒流行病学和遗传变异的研究尚处于空白。【拟解决的关键问题】依据已发表的GoCV序列设计3对引物，对采自广西百色市的鹅组织样品进行GoCV检测，通过套叠PCR和反向PCR扩增获得全长基因组序列，旨在解析GoCV广西流行毒株的全基因组序列及其遗传进化地位，掌握广西GoCV的流行情况，为今后更有效防控GoCV提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

从广西百色市活禽市场采集49份鹅组织样品，包括肺脏、脾脏、肝脏、心脏、肾脏、法氏囊等器官组织，-80 ℃保存备用。MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司； DH5α感受态细胞、TIANquick Midi Purification Kit、TIANprep Mini Plasmid Kit购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1. 2 引物设计及基因组全长扩增

根据GenBank中已发表的GoCV全基因组序列，合成3对扩增产物首尾重叠的引物（表1）用于GoCV全基因組扩增，所有引物均由英潍捷基贸易（上海）有限公司合成。

1. 3 病毒基因组DNA提取

取少量样品组织充分研磨，以无菌PBS（pH 7.4）按1∶5的比例进行匀浆稀释，反复冻融3次后8000 r/min离心10 min，取上清液备用。采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0按说明进行病毒基因组DNA提取。

1. 4 PCR扩增

PCR反应体系25.0 μL：2×Ex Taq Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1.0 μL，基因组DNA模板5.0 μL，以ddH2O补足至25.0 μL。先用引物对F1-22/R543进行扩增，阳性样品再以剩余部分基因组的引物对F505/R1261和F1130/R1821分别进行扩增。

1. 5 PCR产物纯化与克隆

切胶回收目的片段，以TIANquick Midi Purification Kit进行回收纯化，目的基因与pMD18-T载体连接（16 ℃）过夜，并转化DH5α感受态细胞，然后取转化菌液均匀涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂培养基上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落培养12 h后少量提取质粒，经酶切鉴定阳性的质粒送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。

1. 6 全基因序列分析

以DNASTAR的Seqman进行序列拼接得到GoCV全长基因组序列，利用NCBI BLAST软件分析测序结果，并与国内外主要的GoCV分离參考毒株（表2）进行核苷酸及其推导氨基酸比对分析，并构建遗传进化树。

2 结果与分析

2. 1 GoCV全长基因组PCR扩增结果

从49份鹅组织样品中仅检出1份阳性样品，检出率为2.04%，并将该毒株命名为GXTD254。由图1可以看出，所设计的3对引物均能从阳性样品中扩增获得对应的目的片段（图1），且片段大小与预期结果相符合。

2. 2 GoCV测序结果分析

测序结果表明，GXTD254毒株的全基因组长度为1822 nt，GenBank登录号KT207809。该基因组包含4个主要的开放阅读框：ORF V1（Rep蛋白，293个氨基酸）、ORF V2（37个氨基酸）、ORF C1（Cap蛋白，250个氨基酸）及ORF C2（99个氨基酸）。其中，V1编码复制相关蛋白，C1编码外壳蛋白。与其他GoCV毒株一样，GXTD254毒株在V1和C1的5'端之间存在一个保守的TATTATTAC茎环结构（图2中下划线部分），而其他不同代表毒株茎环结构顶部保守序列的第1和第3位碱基略有差异。茎环结构两侧各有一个6碱基正向重复的GGCGCC序列，而与Rep蛋白基因间存在两个连续的正向重复七碱基序列GTACTCC（图2方框部分）；七碱基正向重复序列与Rep蛋白间为一个高变异区域（图2黑底部分）。鉴于各GoCV毒株间该区域高度变异，推测其与病毒自身复制的相关性不明显，但又位于与病毒复制相关Rep蛋白起始密码子的上游区域，也有可能只是影响Rep蛋白的表达（竺春等，2007）。

2. 3 GoCV各基因片段同源性分析

经全基因组序列同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、浙江象山分离毒株（ZJxs1）的核苷酸同源性较高，均在97.0%以上。基于Cap蛋白氨基酸序列的同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk2和ZJyk3）的同源性最高（94.8%），与其他GoCV毒株的差异较明显（表3），说明Cap蛋白变异较大；而基于Rep蛋白氨基酸序列的同源性比对分析，发现GXTD254毒株与浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2和ZJyk3）、浙江象山分离毒株（ZJxs1）的氨基酸同源性较高，均在98.0%以上，与其他地区分离毒株的氨基酸同源性也在96.0%以上（表4），说明Rep蛋白较Cap蛋白相对更保守。

2. 4 GoCV基因组遗传进化树分析

基于GoCV全基因组序列，用MEGA 6.0软件对GXTD254毒株、其他GoCV参考毒株及两株广西分离的DuCV毒株进行遗传进化分析，并绘制遗传进化树（图3），结果显示，GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分离毒株（ZJxs1）的遗传距离最接近，同属于一个遗传分支，再与Germany2001、Germany2008、TW1、TWGB27-20、ZJxs2、ZJxs4等毒株聚为一个大分支；与两株广西分离的DuCV毒株遗传距离最远。

3 讨论

随着我国水禽养殖业的迅速发展，危害水禽的疾病也越来越多，且日趋复杂，控制难度不断加大，已成为严重制约水禽规模化养殖生产的难题，究其原因可能与水禽群中广泛存在的免疫抑制性疾病相关（蔡宝祥，2001；余旭平等，2005）。圆环病毒通常潜伏感染而不引起动物发病，一般侵害宿主体内增殖速度较快的细胞，尤其是淋巴细胞，造成动物生长发育障碍、免疫力下降，易遭受其他疫病的并发或继发感染（万春和等，2010）。Soike等（2004）首先报道在德国一家大型养鹅场发生一种生长发育障碍和死亡率很高的圆环病毒感染，并引起机体免疫抑制而继发细菌感染；病鹅主要表现为发育不良、体重下降、羽毛凌乱等，组织病理学检查发现法氏囊、脾脏和胸腺的淋巴细胞减少，其中以法氏囊病变最明显。此后，英国、我国台湾、匈牙利等地也相继报道了该病毒的存在，从而引起各国的广泛重视。2005年，余旭平等从浙江永康某鹅场感染禽流感的病死鹅中检测到GoCV的存在，怀疑该病毒能引起其他病原的并发或继发感染，协助水禽流感的暴发流行。2007年，杨晓伟等在重庆荣昌某鹅场的病死鹅中也检测到GoCV。目前，广西对GoCV的研究尚处于空白，缺乏病毒流行病学和遺传变异方面的基础数据。

由于GoCV目前尚无法进行体外培养，其研究主要在于核酸扩增及序列测定。本研究采用PCR首次从广西本地鹅组织中检出GoCV，检出率为2.04%。经测序发现，GXTD254毒株全基因组序列包含4个主要的开放阅读框，其中ORF V1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF C1编码病毒的衣壳蛋白。与参考毒株进行同源性比对分析，发现Rep蛋白氨基酸序列相对保守，各毒株间的氨基酸同源性均在96.0%以上；但不同毒株间Cap蛋白氨基酸序列差异较明显，同源性最低的只有69.7%，可能与病毒需要适应宿主免疫系统有关。对病毒Rep和Cap基因5'端间隔区序列进行比对分析，发现GXTD254毒株与其他GoCV毒株一样，存在一个保守的TATTATTAC茎环结构，但圆环病毒其他不同代表株茎环结构顶部保守序列的第1和第3位碱基略有差异，与Phenix等（2001）的研究结果一致。此外，在茎环结构与Rep蛋白基因间存在两个连续的正向重复七碱基序列（GTACTCC），在茎环结构两侧还各有一个正向重复的GGCGCC序列。茎环结构周围的这些重复序列有可能与病毒复制有关，是圆环病毒Rep蛋白的结合位点（Mankertz et al.，1997，2000；Niagro et al.，1998；Todd et al.，2001）。

由构建的遗传进化树可知，GXTD254毒株与4株浙江永康分离毒株（ZJyk1、ZJyk2、ZJyk3和ZJyk4）、1株浙江象山分离毒株（ZJxs1）的遗传距离最接近，同属于一个遗传分支，但與我国台湾的大多数分离毒株（TW1021024G、TWGB21-9、TW6、TW9、TW8和TW10 20111GB）及另外2株浙江象山分离毒株（ZJxs3和ZJxs5）的遗传距离较远，说明目前我国流行的GoCV存在多个分支，进而给GoCV防控工作提出了新难度。

4 结论

目前我国流行的GoCV存在多个分支，广西流行毒株与部分浙江分离毒株在亲缘关系上比较接近，因此可借鉴其成功的GoCV防控经验。

参考文献：

蔡宝祥. 2001. 圆环病毒与禽鸟免疫抑制[J]. 中国家禽，23（19）：6-9.

Cai B X. 2001. Circovirus and immunosuppressive of birds[J]. China Poultry，23（19）：6-9.

田敬，郭婧，孙红霞，袁海霞，陈维虎，余旭平. 2010. 鹅圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，32（11）：867-870.

Tian J，Guo J，Sun H X，Yuan H X，Chen W H，Yu X P. 2010. Development of a real-time PCR assay for detection of goose circovirus[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，32（11）：867-870.

万春和，施少华，程龙飞，傅光华，陈红梅，黄瑜. 2010. 朗德鹅圆环病毒全基因组序列测定和遗传演化分析[J]. 中国动物传染病学报，18（4）：6-12.

Wan C H，Shi S H，Cheng L F，Fu G H，Chen H M，Huang Y. 2010. Genomic cloning and sequence analysis of circovirus from Landes geese[J]. Chinese Journal of Animal Infections Diseases，18（4）：6-12.

徐雅萍，田敬，袁海霞，郭靖，孙红霞，栗文文，陳维虎，余旭平. 2012. 鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染性实验[J]病毒学报，28（1）：29-34.

Xu Y P，Tian J，Yuan H X，Guo J，Sun H X，Li W W，Chen W H，Yu X P. 2012. Construction and transfection experiment of a goose Circovirus infections clone[J]. Chinese Journal of Virology，28（1）：29-34.

杨晓伟，赵光伟，黄伟，陈玉先. 2007. 重庆地区一例鹅圆环病毒病的PCR诊断[J]. 中国家禽，29（13）：26-27.

Yang X W，Zhao G W，Huang W，Chen Y X. 2007. Goose Circovirus disease diagnosed by PCR from Chongqing[J]. China Poultry，29（13）：26-27.

余旭平，郑新添，何世成，朱军莉，沈琴芳. 2005. 鹅圆环病毒浙江永康株全基因组的克隆及序列分析[J]. 微生物学报，45（6）：860-864.

Yu X P，Zheng X T，He S C，Zhu J L，Shen Q F. 2005. Cloning and analysis of the complete genome of a goose Circovirus from Yongkang Zhejiang[J]. Acta Microbiologica Sinica，45（6）：860-864.

竺春，赵秀玲，袁佳杰，黄贤波，胡东建，余旭平. 2007. 鹅圆环病毒研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯，（4）：6-7.

Zhu C，Zhao X L，Yuan J J，Huang X B，Hu D J，Yu X P. 2007. Research progress of goose Circovirus[J]. Animal Husbandry and Veterinary Communications of Shangha，（4）：6-7.

Chen C L，Chang P C，Lee M S，shien J H，Ou S J，Shieh H K. 2003. Nucleotide sequences of goose circovirus isolated in Taiwan[J]. Avian Pathology，32（2）：165-171.

Mankertz A， Hattermann K， Ehlers B， Soike D. 2000. Cloning and sequencing of columbid circovirus（coCV），a new circovirus from pigeons[J]. Archives of Virology，145（12）：2469-2479.

Mankertz A，Persson F，Mankertz J，Blaess G，Buhk H J. 1997. Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus[J]. Journal of Virology，71（3）：2562-2566.

Niagro F D，Forsthoefel A N，Lawther R P，Kamalanathan L，Ritchie B W，Latimer K S，Lukert P D. 1998. Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes：intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses[J]. Archives of Virology，143（9）：1723-1744.

Phenix K V，Weston J H，Ypelaar I，Lavazza A，Smyth J A，Todd D，Wilcox G E，Raidal S R. 2001. Nucleotide sequence analysis of a novel circovirus of canaries and its relationship to other members of the genus Circovirus of the family Circoviridae[J]. Journal of General Virology，82（11）：2805-2809.

Scott A N，Beckett A，Smyth J A，Ball N W，Palya V，Todd D. 2006. Serological diagnosis of goose circovirus infections[J]. Avian Pathology，35（6）：495-499.

Soike D，Albrecht K，Hattermann K，Schmitt C，Mankertz A. 2004. Novel circovirus in mulard ducks with developmental and feathering disorders[J]. The Veterinary Record，154（25）：792-793.

Todd D， Weston J H， Soike D， Smyth J A. 2001. Genome sequence determinations and analyses of novel circoviruses from goose and pigeon[J]. Virology，286（2）：354-362.

（責任編辑 兰宗宝）