关山樱花总黄酮含量测定及其亚硝酸盐清除作用

李飞阳 姚文红 孙立梅 张林超

摘要：本试验利用分光光度法测定了关山樱花总黄酮含量，研究了关山樱花总黄酮对亚硝酸盐的清除作用。结果表明：关山樱花中总黄酮含量测定的最佳显色体系为Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系，该方法最佳测定时间为显色后20～45 min范围内，测定方法精密度RSD=0.49% （n=5 ），加标回收率为102.55%（RSD=1.13%），利用该法测得关山樱花样品总黄酮含量为11.25% （RSD=1.44%，n=5）；在体外模拟胃液条件下，关山樱花总黄酮浓度在4.00～96.00 μg/mL范围内，对亚硝酸盐的清除率从14.64%±0.83%增加到99.42%±0.40%，半数清除率IC50值为18.85 μg/mL，清除效果强于VC。该测定方法简便准确，且获得的关山樱花总黄酮对亚硝酸盐的清除效果显著。

关键词：关山樱；总黄酮；亚硝酸盐；清除作用

中图分类号：S685.99文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）10-0140-05

樱花是蔷薇科Rosaceae 李亚科Prunoidea 樱属Cerasus观赏植物的统称[1]，原产于北半球温带环喜马拉雅山地区，经两千多年研究培育，由本种及其变种与其他种类杂交培育而成的樱花品种超过300种以上。关山樱Cerasus.lannesiana Alborosea俗称“红缨”，为日本晚樱代表品种，植株平均高度2.5 m，小枝多而上弯，嫩叶茶褐色，秋叶橙黄可比银杏，花期3月底或4月初，数朵丛生，花色深粉，幽香艳丽，花梗粗长，花茎6 cm左右，花瓣繁复，约30瓣，2枚雌蕊叶化，不能结实，在中国栽植广泛，北起黑龙江、华北各省，南至海南、云南、广东、广西，西到青海、甘肃、新疆均有种植。

樱花是驰名世界的木本花卉，花开时绚丽灿烂，如云似霞，因此，世界各国科学家对樱花的研究主要集中在生物学特性[2-4]、繁殖技术[5，6]、病害防治[7]、遗传多样性[8]等方面，对其有效成分和药理作用的研究鲜见报道，虽有学者对樱花中挥发油[9]、多糖[10]及其提取物抗氧化性[11，12]进行过研究，但是关于黄酮类化合物的研究未见报道。本研究以关山樱为试验材料，首次对其花中总黄酮含量进行测定，进一步研究了关山樱花总黄酮的亚硝酸盐清除作用，以期为关山樱有效成分的开发与利用提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验材料关山樱花采自青岛崂山水峪景区，由青岛农业大学农学与植物保护学院罗兰教授鉴定为关山樱的花。

1.1.2试剂与仪器试剂：芦丁（南京狄尔格医药科技有限公司）；抗坏血酸（天津市永大化学试剂有限公司）；试剂均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。

仪器：UV-1601型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；SP-722型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；AR1140型电子天平（上海奥豪斯国际贸易有限公司）；FW-100型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；DZX-1型真空干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DF-101B型集热式磁力加热搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）等。

1.2试验方法

1.2.1显色体系选择将关山樱花50℃烘干并粉碎，过60目筛，按照质量体积比1∶10加入石油醚浸泡24 h，脱脂干燥后，制得样品。准确称取样品0.500 0 g以上，按照质量体积比1∶50加入50%乙醇25 mL，于70℃恒温水浴条件下回流提取1 h，趁热过滤，待其冷却至室温，定容至100 mL，制得样品液。准确称取50℃恒温干燥至恒重的芦丁标准品50.5 mg，用50%乙醇溶液溶解后定容至250 mL，制得标准液。

原液光谱扫描：准确移取标准液2.00 mL，样品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，在200～600 nm波长范围内，进行紫外-可见吸收光谱扫描。

AlCl3-NaAc显色体系光谱扫描：准确移取标准液2.00 mL，样品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2.00 mL，1.0 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，混合均匀后，静置25 min，在200～600 nm波长范围内，进行紫外-可见吸收光谱扫描。

Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系光谱扫描：准确移取标准液1.00 mL，样品液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，加入0.75 mol/L亚硝酸钠0.50 mL，混合均匀后，静置6 min；加入0.25 mol/L硝酸铝0.50 mL，混合均匀后，静置6 min；加入1.0 mol/L氢氧化钠5.00 mL，用50%乙醇定容至25 mL，混合均匀后，静置25 min，在200～600 nm波长范围内，进行紫外-可见吸收光谱扫描。

1.2.2标准曲线制作准确移取标准液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00 mL于25 mL容量瓶，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系进行显色反应，于510 nm测定吸光度，制作标准曲线，标准液浓度c对吸光度A的一次线性回归方程为：A=10.419 69c-0.005 71，R=0.999 69，表明标准品在0.008 1～0.088 9 mg/mL浓度测定范围内，线性关系很好。

1.2.3稳定性试验准确移取样品液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系进行显色反应，于510 nm每隔2 min测定吸光度，连续测定120 min，平行3次，以确定最佳测定时间。

1.2.4精密度试验准确移取样品液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系进行显色反应，于510 nm测定吸光度，平行5次，计算RSD。

1.2.5加标回收率试验按表2所示，加入标准液和样品液，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系进行显色反应，于510 nm测定吸光度，计算加标回收率。

1.2.6总黄酮含量测定按照1.2.1中样品液制备方法进行试验，平行5次，得到5份关山樱花总黄酮提取液；分别准确移取提取液2.00 mL，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系进行显色反应，测定吸光度，平行3次；依据下式计算关山樱花样品总黄酮含量。

总黄酮含量（%）=

（A+0.00571）×25×10010.419 69×1000×2.00×m×100

式中：A为吸光度，m为样品质量（g）。

1.3亚硝酸盐清除作用

将关山樱花提取液合并后，进行旋蒸，除去乙醇，加入适量蒸馏水，配制成总黄酮浓度为1.00 mg/mL的关山樱花待测液。准确移取pH 3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液10.00 mL，分别加入1.00 mg/mL待测液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00 mL，加入100 μg/mL的NaNO2溶液2.00 mL，用蒸馏水分别补至25.00 mL，混合均匀后，保持温度为37℃，恒温加热1 h，让待测液与亚硝酸盐充分反应。冷却后，准确移取反应液2.00 mL，分别加入4 mg/mL对氨基苯磺酸4.00 mL，2 mg/mL N-1-萘乙二胺盐酸盐4.00 mL，混合均匀后，静置15 min，以同浓度待测液为参比，于540 nm 测定吸光度[13，14]，重复3次。

采用上述方法，测定VC溶液亚硝酸盐清除能力，与待测液进行对比。

2结果与分析

2.1显色方法选择

由图1可知，采用3种显色体系进行试验，样品液的紫外-可见吸收图谱具有黄酮类化合物特征吸收峰，但与标准液相比，峰位、峰形均有一定差别，说明样品液中所含黄酮类化合物的结构与标准品不尽相同。尤其是原液扫描图谱中，与标准液在240～285、300～450 nm处吸收峰相比，样品液吸收峰分别发生蓝移和红移，合并为一个峰；AlCl3-NaAc显色体系扫描图谱中，样品液在345～500 nm处的吸收峰发生55 nm红移、标准液与样品液在245～300 nm处的吸收峰，最大吸收波长位置稍有偏差；而Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系扫描图谱中，标准液与样品液吸收峰位置、峰形相似程度很高，特别是450～600 nm处吸收峰，峰形平缓，吸光度与浓度呈线性关系，而且原液在该处无吸收峰，对含量测定不会产生影响，因此，关山樱花总黄酮含量测定最佳显色体系为Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系，最佳测定波长为510 nm。

2.2稳定性试验

由图2可以看出，开始阶段，显色络合物不够稳定，所测吸光度值及其标准偏差较大，45 min后所测吸光度值逐渐减小，标准偏差增大，可能是显色络合物部分发生分解所致，只有20～45 min时间范围内，所测吸光度值RSD=0.026%，明显小于0～120 min时间范围内测得吸光度值RSD=2.27%。说明，该时间范围内，显色络合物更加稳定，因此，关山樱花总黄酮含量测定最佳时间为显色反应后20～45 min范围内。

2.3精密度试验

由表1可知，采用该方法测定关山樱花总黄酮含量，精密度RSD=0.49% （n=5），该测定方法准确可行。

2.4加标回收率试验

由表2可知，采用该法测定关山樱花总黄酮含量，加标回收率的示值范围在100.03%～103.96%之间波动，平均值102.55%，RSD=1.13%，符合定量分析要求。

2.6亚硝酸盐清除作用

如图3所示，在保持反应温度为37℃、反应液pH值为3、恒温水浴加热1 h的条件下，关山樱花待测液中总黄酮浓度由4.00 μg/mL递增至96.00 μg/mL时，亚硝酸盐清除率由14.64%±0.83%逐渐增加到99.42%±0.40%，总黄酮浓度与亚硝酸盐清除率基本呈对数关系；同浓度VC对亚硝酸盐的清除率，在16.00～32.00 μg/mL之间从18.57%±1.66%突变为88.80%±0.40%，接近VC最大清除率95.22 μg/mL，使得总黄酮浓度在21.15～58.11 μg/mL之间时，关山樱花待测液亚硝酸盐清除率小于同浓度VC，但在其它浓度范围，关山樱花待测液亚硝酸盐清除率均大于同浓度VC，而且最大清除率明显高于VC；关山樱花待测液IC50值为18.55 μg/mL，小于VC的IC50值20.68 μg/mL。由此可见，关山樱花总黄酮亚硝酸盐清除效果优良，具有实际应用价值。

3讨论与结论

亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色固体，外观和滋味与食盐相似，在工业、建筑业中广为使用，也允许作为发色剂限量使用于肉类制品中。亚硝酸盐能使人体血液中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去携氧能力，从而引起组织缺氧，呼吸中枢麻痹，摄入0.3～0.5 g亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。食物中大量存在亚硝酸盐，还是亚硝胺前体物，联合国环境规划署1987年报道：已发现130多种亚硝胺中，80%以上可致癌，是国内外医学界公认最强化学致癌物之一，大量医学研究证明：食道癌、胃癌、肝癌等癌症发病率与亚硝盐摄入量密切相关[15]。关山樱花提取物对亚硝酸盐有很强的清除能力，具有进一步开发利用的潜在价值。

本试验选择Al（NO3）3-NaNO2-NaOH显色体系，采用分光光度法测定关山樱花总黄酮含量，该法操作简单，线性关系良好，精密度和回收率均达到测定要求，该方法测得关山樱花样品总黄酮含量为11.25%，但关山樱花经过脱脂处理后，样品质量约损失5%，使得所测数据偏高。樱花品种、生长环境、气候变化等因素差异，是否会导致所含黄酮类化合物结构、含量产生差异，樱花有效成分的分离、药理活性等问题，有待进行更加深入的研究。

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