稳定沉默TIPE2后削弱PolyI：C诱导的人单核/巨噬细胞凋亡

江洁曙　王珊珊　方晶晶

[摘要] 目的 观察TIPE2稳定沉默后对TLR激动剂Poly I：C诱导THP-1凋亡的影响。 方法 以THP-1细胞为研究对象，使用不同TLR激活剂与THP-1细胞孵育后，采用荧光定量PCR检测TIPE2 mRNA表达。应用慢病毒技术稳定沉默TIPE2表达后，MTT法检测细胞增殖，Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，免疫印迹分析TIPE2沉默后Caspase-8表达水平变化。 结果 TLRs激活剂中TLR3特异性激活剂Poly I：C可以显著上调TIPE2的表达（P<0.05），随作用时间延长，可显著抑制THP-1细胞增殖，并可诱导细胞凋亡。利用慢病毒技术稳定沉默THP-1细胞中TIPE2表达以后，可显著削弱Poly I：C诱导的TIPE2表达（P<0.05），TIPE2沉默后，Poly I：C抑制THP-1增殖和诱导细胞凋亡的效应显著削弱，随后免疫印迹的结果显示，Caspase-8的活化形式，p41/42表达下调。 结论 Poly I：C通过上调TIPE2表达可抑制THP-1细胞增殖，并可诱导细胞凋亡，稳定沉默TIPE2后可一定程度削弱上述效应，可能与下调Caspase-8的活性形式表达有关。

[关键词] Poly I：C；TIPE2；免疫；TLR；凋亡

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）16-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of stably silent TIPE2 on THP-1 apoptosis induced by TLR agonist Poly I：C. Methods THP-1 cells were selected as the study subjects. The expression of TIPE2 mRNA was detected by fluorogenic quantitative PCR after incubation of THP-1 cells with different TLR activating agents. After stable silence of TIPE2 by lentiviral technique， the cell proliferation was detected by MTT， apoptosis was detected by Annexin V/PI double-staining method， and changes of Caspase-8 expression level after silence of TIPE2 was analyzed by western blot. Results TLR3 specific activator Poly I：C could significantly up-regulate the expression of TIPE2（P<0.05）. Along with the time of action， it could significantly inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis. Stable silence of TIPE2 in THP-1 by lentiviral technique could significantly impair the TIPE2 expression induced by Poly I：C （P<0.05）. After silence of TIPE2， the effects of Poly I：C on inhibition the proliferation of THP-1 and induction of apoptosis were significantly impaired， and the result of following western blot showed active form of Caspase-8 and down-regulation of p41/42 expression. Conclusion By up-regulating the expression of TIPE2， Poly I：C can inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis， which can be partially impaired by stable silence of TIPE2， possibly due to down-regulation of Caspase-8 active form expression.

[Key words] Poly I：C； TIPE2； Immune； TLR； Apoptosis

免疫系统内稳态的维护机制极其复杂和神秘，改变调控免疫细胞死亡或者活化扩增免疫细胞均可以打破免疫细胞的内稳态环境，最终带来极为致命的炎性疾病，目前研究发现一组超家族蛋白对免疫系统的内稳态维持至关重要。尤其是具有hexahelical bundle 结构的蛋白称之为死亡效应domain（DED），与Caspase家族蛋白的CARD结构域以及募集区域有结构类似，参与到细胞死亡和其他的信号通路中。

TIPE中坏死因子诱导蛋白8-类似蛋白2作为这类家族蛋白的成员之一，近年来，在机体免疫的内稳态中扮演重要作用，其主要机制与调控T细胞受体和Toll样受体信号通路有关，除了在炎症组织中表达外，TIPE2还在髓样组织和多种肿瘤细胞中表达，说明其中可能发挥着不同的功能[1]。有报道显示，TIPE2可以调控Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）的表达，并对周围不同的刺激信号强度产生响应[2]。但是上游TLR的活化是否也可以影响TIPE2的表达，是否可以影响人单核/巨噬细胞活性和增殖？尚未见有相关的报道。本项目于2014年1月～2015年12月期间，以人单核细胞株THP-1为考察对象，考察不同TLR激动剂对TIPE2表达的影响，并探讨相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和TLR激动剂处理

人THP-1细胞购自中国科学院上海细胞库。新生牛血清，DMEM培养基和0.25%胰蛋白酶购自美国Life technology公司；人TLR1-9激动剂购自InvivoGen公司，抗人TIPE2和Caspase-8抗体购自Abcam公司。其余试剂均为国产分析纯。THP-1细胞培养在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青-链霉素霉素的DMEM培养液中，置于含有5%CO2，37℃培养箱中，每隔2～3天换液。取对数生长期细胞进行实验。细胞计数后将试剂盒中的TLR1-9特异性激动剂用培养液稀释后使用，终浓度分别为0.1 μg/mL和1 μg/mL，孵育24 h后，Trizol裂解细胞，提取RNA，按照方法1.6中的描述检测TIPE2 mRNA表达水平。

1.2细胞抑制实验

细胞抑制率使用四甲基偶氮噻唑蓝法（methlthiazoletrazolium assay，MTT assay），将THP-1细胞以1×104/mL密度接种于6孔或12孔板，置于培养箱中培养24 h后，Poly I：C配置成10 mg/mL储液，使用时用完全培养稀释，加入到细胞中使得终浓度分别为0.1 μg/mL、1 μg/mL，设置空白对照组。于24 h后收集细胞，加入5 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h后，弃上清每孔加150 μL DMSO后在酶标仪上570 nm处读取吸光值（OD）。实验重复3次。计算抑制率=（1-ODPloyI：C/OD空白对照组）×100%。稳定沉默TIPE2后的细胞抑制率基本方法同上，实验前1 d细胞按1×104/孔铺96孔板，设shTIPE2稳定沉默组（经过嘌呤霉素筛选后稳定沉默TIPE2的THP-1细胞），shScramble组（经过嘌呤霉素筛选后的空白载体组），加入Poly I：C后孵育24 h后加入MTT检测细胞在570 nm处的吸光度值变化。

1.3慢病毒载体构建以及稳定沉默TIPE2细胞株建立

退火形成双链DNA片段。与双酶切线性化后的pLKO.1-TRC载体（含GFP编码序列）连接。取4 μL所得的连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃恒温培养过夜。挑取3个单克隆菌落接种至Ampicillin抗性的LB培养液中，小摇过夜。用试剂盒小量提取质粒后，分别用EcoRI和NcoI酶切鉴定，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。鉴定正确的质粒命名为：pLKO.1-TRC-TIPE2-shRNA1。将酶切鉴定正确的细菌送测序以进一步确认序列。

病毒包装时，转染前1 d对293T细胞进行分皿。使用脂质体转染法将含shTIPE2或shScramble质粒，分别同pΔ8.91及pMD2.G这2个包装质粒按照10∶10∶1的质量比混合后，共转染293T细胞。12 h后更换完全培养基。37℃培养箱中继续培养，并在荧光显微镜下观察荧光表达情况。48～72 h期间收集上清，0.45 μm滤器过滤后备用。感染时，取对数生长期THP-1细胞，接种于6孔板培养12 h后，弃上清每孔滴加含病毒液体200 μL，加入含polybrene（浓度4 μg/mL）的培养基，感染8 h后换普通培养基；48 h后加含嘌呤霉素（浓度0.5 μg/mL）的培养基，隔2 d更换该培养基。3次筛选后加普通培养基培养24 h后收集细胞于培养瓶中培养，进行后续实验。

1.4 细胞凋亡检测

对细胞凋亡分析，使用细胞凋亡检测试剂盒（Becton Dickinson公司，美国）进行膜联蛋白V-FITC/PI双染色。以不同浓度的Poly I：C处理24 h处理后，收集THP-1细胞，PBS漂洗一遍后，300 μL结合缓冲液重悬细胞，加入FITC标记膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）各5 μL，避光孵育15 min，随后在细胞悬液中再加入200 μL结合缓冲液，过200目尼龙网后通过BDAccuriTMC6流式细胞分析。利用单染Annexin V和PI的细胞设门后，统计凋亡细胞和存活细胞比例。

1.5 荧光定量PCR

收集各组细胞，用Trizol提取细胞总RNA，使用MMLV逆转录酶逆转录为cDNA。以各组cDNA为模板，加入缓冲液、引物等进行PCR，各样本重复3次。TIPE2：上游引物序列5- GGA ACA TCC AAG GCA AGA CTG-3-，下游引物序列5- AGC ACC TCA CTG CTT GTC TCA TC-3；GAPDH作为内参对照序列上游引物5-GT CGT ATT GGG CGC CTG GTC ACC-3，下游引物5-CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG GGC-3。20 μL反应体系中包括2×SYBR？誖Premix Ex TaqTM II 10 μL，上游引物（10 μM）0.5 μL，下游引物（10 μM）0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，反应条件95℃预变性3 min，以下步骤进行30个循环：95℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。每份标本设3个复孔，取其循环阈值（Ct）均值，分别计算各组的ΔCt（Ct目的基因-Ct内参基因），再以正常组为1进行均一化，以2-ΔΔCt表示基因的相对表达水平。

1.6 免疫印迹

THP-1细胞经Poly I：C处理24 h后，冷PBS漂洗一遍，RIPA裂解细胞，收集蛋白并用BCA法测定蛋白浓度。按20 μg/泳道蛋白量进行SDS-PAGE电泳，转膜并用脱脂牛奶封闭后，加入抗TIPE2抗体（1∶2000）和β-actin（1∶4000）抗体于4℃孵育过夜。取出膜用TBS-T漂洗3次后，将膜和相应2抗（1∶5000）在摇床上室温孵育1 h，取出膜后TBS-T漂洗3次后，加入ECL化学发光试剂显色后，用LI-COR免疫印迹成像系统进行扫描，GAPDH条带为内参。

1.7 统计学分析

应用GraphPad Prism软件进行差异显著性分析。实验结果数据为3次独立实验均值，计量结果用均值±标准差（x±s）表示，符合正态分布，则两组间比较根据数据类型采用独立样本t检验，多组间比较用ANOVA方差分析；若不符合正态分布，则采用非参数 Mann-Whitney 检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同TLR激活剂对TIPE2表达的影响

从封三图1A中来看，TIPE2受到Poly I：C活化的影响，其他特异性激动剂也有一定的变化，但是Poly I：C对TIPE2的上调作用（相对表达强度在0.1 μg/mL和1 μg/mL时候分别为（0.80±0.06）和（2.30±0.21）最为显著，Poly I：C主要为TLR3的激动剂。既往有研究显示，Poly I：C可抑制多种细胞的增殖，并可诱导凋亡[3]，利用MTT实验检测不同浓度Poly I：C对THP-1细胞抑制率的影响，结果如封三图1B和1C所示，Poly I：C可对THP-1细胞有显著的抑制，在1 μg/mL时候其抑制率可到达42%，同时随着作用时间的延长抑制率逐渐上调。随后，用Annexin V/PI双染检测Poly I：C作用后对THP-1细胞凋亡的影响，结果发现，随Poly I：C浓度增加凋亡细胞逐渐增加而存活细胞显著减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。见封三图1D。

2.2 TIPE2 稳定沉默细胞株建立

既往研究显示，TIPE2可能参与Caspase-8的活化，因此为了证实TLR3特异性抑制Poly I：C对THP-1的抑制和诱导凋亡可能与TIPE2的上调有关，通过慢病毒技术稳定沉默THP-1细胞中TIPE2的表达，如封三图2A所示，将构建好的载体转化感受态细胞DH5a后，小抽得到质粒，并惊醒酶切鉴定，原质粒在酶切后的片段大小应为7872、2155和190 bp，而接入shRNA后荧光为7872、190、303和42，对于酶切正确的质粒送去测序进行验证（封三图2B），取正确的质粒大抽以后去内毒素用于转染包装病毒用。如封三图2C所示，得到的病毒滴度较高，可以较好的感染THP-1细胞，随后对TIPE2用免疫印迹进行验证后如封三图2D所示，设计的3个shRNA都可以比较好的沉默TIPE2的表达。

2.3 TIPE2沉默后对Poly I：C诱导凋亡的影响

如封三图3所示，用Poly I：C处理稳定沉默TIPE2的THP-1细胞后发现，shScramble组中的TIPE2对Poly I：C依然有很好的响应，可以显著上调TIPE2的表达，而在shTIPE2组，Poly I：C对TIPE2的mRNA上调作用被显著削弱。随后比较shScramble组和shTIPE2组在Poly I：C处理后对细胞抑制率的影响，结果显示shScramble组的细胞抑制率为（41.2±4.3）%，而在shTIPE2组为（16.0±2.3）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。随后利用流式细胞检测凋亡情况发现，在Poly I：C处理24 h后，shTIPE2组中凋亡细胞比例为（15.2±1.6）%，而在shScramble组中为（32.2±3.9）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。提示TIPE2稳定沉默后可显著削弱由Poly I：C诱导的THP-1的凋亡。随后，分析Caspase-8的表达情况发现，在shTIPE2组中，活化形式p41/42表达下调。

3 讨论

TLR是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中发挥重要作用，是联系天然免疫与适应性免疫的桥梁。近年来，研究表明TLR介导的天然免疫在病毒诱导的炎性细胞损伤过程中同样具有重要意义。TLR3是TLR家族中的重要成员，由胞外富含亮氨酸的重复序列、膜结构域和胞质内激酶结构域组成[4]。能够特异性的识别致病性病毒的双链dsRNA。双链RNA （double stranded RNA，dsRNA）是TLR3所识别的病原相关分子模式（PAMP），多种病毒在复制期间可以产生大量的dsRNA，因此，TLR3可以作为机体抗病毒的重要防线。TLR3不仅在宿主抗病毒过程中具有重要作用，而且还与一些自身免疫病的发生存在密切关系。近期研究发现，坏死细胞释放的RNA或体外转录产生的mRNA同样可以活化TLR3，提示体内坏死组织释放的RNA可以作为TLR3的内源性配体启动或调节免疫应答。由于大部分自身免疫病并未发现与病毒感染具有直接联系，因此，内源性配体对TLR3的活化在自身免疫病的发病机制中可能具有重要意义。

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2，TIPE2）作为一种新发现的蛋白分子，与肿瘤坏死因子诱导蛋白-8家族成员拥有某些共有序列，TIPE2选择性表达的在淋巴源性和髓源性免疫细胞中，对固有免疫和细胞免疫起到负性调控作用。可抑制激活转录因子ap-1和nf-kb的活化[2，5]。与小鼠主要在淋巴细胞中表达所不同的是，tipe2在人体的多数组织中都有表达，比如干细胞、神经元脑组织和脑干中、食管以及宫颈的鳞状上皮细胞中、膀胱和尿道的交界处、结肠、胃腺上皮细胞、结肠、阑尾中都有表达[6]。尤其在终末分化的细胞中为高表达，前体细胞表达下调，提示一方面与增殖有关，一方面与分化以及相关蛋白的形成有关。tipe2在多个疾病中都呈现异常表达，包括肝炎[7]、肝癌、中风[8]、肾排异反应[9]、HCV、哮喘[10]、重症肌无力[11]、红斑狼疮[12]等。患者的外周血中tipe2的表达在多种自身免疫性疾病中都是下调的，提示免疫细胞处于高度活化状态。通过特异性诱导免疫细胞中TIPE2的表达，或许有助于减少抑制自身免疫细胞活性，减少对正常组织的损伤。

有研究显示内源性TLR3的激活剂，Poly I：C可以诱导多种细胞的凋亡，如胆管上皮细胞，进而可能在肝硬化炎性损伤中发挥作用[13]。外源性的或者内源性的dsRNA可以通过TLR3或IRF-3途径诱导多种细胞死亡，如胰腺β细胞死亡[14]、前列腺癌[15]、唾液腺上皮细胞[16]。TLR3是模式识别受体，所引起的凋亡主要与Caspase-8有关[17]。TIPE2作为Caspase-8 重要的伴侣蛋白，在其活性的发挥中扮演重要作用，因此可以认为Poly I：C刺激TLR3 活化后所引起的细胞凋亡中，其中一个途径为通过活化Caspase-8和TIPE2 实现。此外，在肿瘤中的研究显示[18]，TIPE2在多种肿瘤中表达下调，且tipe2是ras的主要抑制因子，通过抑制Ralgds后抑制ras复合物的形成，最后引起ral和akt的抑制，如果上调以后则可引起ras活性下降，细胞增殖下降，迁移减少。因此，我们推断Poly I∶C刺激活化tlr3 以后通过上调tipe2的表达，可能还可进一步引起ras的抑制，从而抑制细胞增殖，并可能影响细胞的迁移，吞噬和抗菌的能力。tipe2缺失后肝癌细胞增殖和迁移速度加快，并可以抑制细胞胞吐，而过量表达tipe2以后则可以抑制体内外肝癌细胞则增殖迁移和侵袭[19， 20]，后续研究显示和rac1和减少F-actin以及MMP-9，以及uPA的活化有关，我们在研究中也观察到沉默tipe2后，thp-1细胞增殖加快，与既往研究相吻合[19，20]。

因此，TIPE2不仅在自身免疫系统疾病中扮演重要作用，同时在肿瘤的发展中也具有一定的意义，人为上调TIPE2在肿瘤细胞中的表达可能有助于抑制癌细胞增殖和迁移，但是也有可能影响免疫细胞的活化，因此，如果将TIPE2作为药物靶点开发肿瘤治疗药物时，应该注意到对正常免疫系统的负面影响。

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（收稿日期：2016-02-19）