降香黄檀、檀香根际解钾菌的筛选与活性研究

罗娜 周德明 徐睿 周国英

摘 要 为提高降香黄檀-檀香人工林的土壤肥力，从不同林龄的降香黄檀、檀香根际土壤中分离筛选高效解钾菌。从钾细菌富集培养基上初筛和解钾菌筛选培养基复筛得到可培养物89个。采用原子吸收分光光度法测定菌株解钾能力。结果表明，可溶性钾含量在70 μg/mL以上的菌株有6株，其中菌株JT-K21、JT-K11和JT-K18的解钾率为80%以上。JT-K21培养液的可溶性钾含量高达132.68 μg/mL，解钾率达到221.18%。基于形态学、生理生化特性及16S rDNA序列比较分析，初步鉴定JT-K21为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。不同碳氮源试验表明：JT-K21对蔗糖和硫酸铵的吸收效果最好。通过单因素试验及正交试验结果表明：菌株JT-K21液体发酵菌体浓度最大培养组最优组分为蔗糖（10 g/L）、硫酸铵（0.2 g/L）、氯化钠（0.1 g/L）、钾长石（5 g/L）；JT-K21液体发酵解钾活性最佳时，培养基最优组分为蔗糖（10 g/L）、硫酸铵（0.2 g/L）、氯化钠（0.1 g/L）、钾长石（3 g/L）。

关键词 降香黄檀；檀香；解钾菌

中图分类号 S792.28；S182 文献标识码 A

Abstract To improve the soil fertility of the mixed forests Dalbergia Odorifera and Santalum album L.， the high efficiency potassium utilization bacteria were isolated and screened from the rhizosphere soil of different ages of D. Odorifera and S. album L.. By potassium bacteria culture medium and potassium-releasing bacteria culture medium， 89 bacteria strains were obtained and cultivated. The ability of dissolving potassium of the 89 isolates were determined with the atomic absorption spectrophotometer method. As the results showed that six bacteria strains had the content of soluble potassium more than 70 μg/mL. Among them， the strains JT-K21， JT-K11 and JT-K18 were of the potassium solvability above 80%. The culture medium of JT-K21 with the soluble potassium content reached 132.68 μg/mL， potassium solvability reached 221.18%. Based on morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， strains JT-K21 was preliminarily identified as Pseudomonas putida. As the result of carbon and nitrogen source test showed that： strains of JT-K21 had the best absorptive effect on sucrose and ammonium sulfate. By single factor and orthogonal test， when JT-K21 liquid fermentation cell concentration reached the maximum， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride（0.1 g/L）， feldspar（5 g/L）. When JT-K21 liquid fermentation dissolved potassium activity reached the highest， the optimal culture medium component was sucrose（10 g/L）， ammonium sulfate（0.2 g/L）， sodium chloride （0.1 g/L）， feldspar（3 g/L）.

Key words Dalbergia Odorifera；Santalum album L.；Potassium releasing bacteria

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.018

解钾菌称硅酸盐细菌（Silicate bacteria），能有效分解含钾矿物，利用磷、钾等矿物元素；主要有土壤芽胞杆菌（Bacillus edaphicus）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）和胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）等[1]。钾是作物营养的三要素之一，在植物生长发育的过程中，参与了60种以上酶系统的活化、光合作用以及同化产物的运输、碳水化合物的代谢和蛋白质的合成等过程，同时还能增强作物的抗病虫害、抗倒伏、抗旱和抗寒等抗逆能力。中国土壤中可溶性钾资源匮乏，但是以钾长石为主的难溶性硅铝酸钾资源存储丰富，分布广泛，南方储存尤为丰富[2]。化学肥料虽然见效快、投入小，但易造成土壤结构破坏、有机质含量下降[3]，且污染环境。近年来发现，根际解钾微生物与普通解钾菌相比，它不仅能转化土壤难溶性钾、改造土壤结晶构造[4]；还能分泌促生物质，活化植物根际土壤微生态环境，促进植物生长[5]。Sugumaran等[6]从土壤中筛选得到一株解钾菌，其解钾能力达 4.29 mg/L，将其施用于土壤中，使得土壤可溶性钾上升至99.60 mg/kg，植物干重增大125%，有机质增加35.41%。通过从特定植物根际分离筛选出高效解钾菌，对于发展现代生态农业具有十分重要的意义。

降香黄檀（Dalbergia odorifera），别名黄花梨，商品名Scentedroswood（香红木），是原产于中国海南的一种豆科蝶形花亚科的常绿乔木，国家二级重点保护野生濒危树种，珍稀的红木树种，广泛分布于中国海南、广东等地及东南亚地区。因其生长缓慢、极难成材，是高档家具、香料的重要原料及名贵的药材来源，现已濒临灭绝。多年来中国林业部门在研究“降香黄檀”的育苗工作中曾投入了大量的人力、物力、财力，但成活率较低[7-8]。檀香（Santalum album Linn.）为半寄生树种，其根部的木质部能长出新组织进入被寄主植物的木质部形成吸盘，进行水分和养分交换。无寄主的情况下幼年期的檀香可存活1 a左右，甚至生活更久，但通常有寄主的檀香会生长更好[9-11]。野生的降香黄檀、檀香多生长在较贫瘠的土壤环境中，人工移植后抗逆能力较差，为加快降香黄檀、檀香产业发展，缩短人工培育周期，增强植株抗逆能力，显得尤为迫切。本研究从降香黄檀、檀香原产地海南降香黄檀、檀香主要种植区的土壤中分离筛选高效解钾菌，并对其进行鉴定，同时对菌株的发酵条件进行了优化，为研制降香黄檀、檀香专用生物肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 土壤样品采自海南省降香黄檀、檀香主要种植区，利用五点随机采样法。用小铲除掉表层土，取4、5、6、7、10年生的降香黄檀、檀香根际土壤（20～40 cm）。分别装入保鲜袋（无菌）中，贴上标签，4 ℃保存带回实验室分离。

1.1.2 供试培养基 （1）钾细菌富集培养基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaSO4.2H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，琼脂18 g/L，去离子水，pH7.2。

（2）钾细菌筛选培养基：葡萄糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.2 g/L，钾长石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（150 目） 2.5 g/L，琼脂18 g/L，去离子水，pH7.2。

（3）LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂18 g/L，去离子水，pH7.2[12]。

1.2 方法

1.2.1 根际高效解钾菌分离 分别称取不同土样10 g，置入装有90 mL0.85%NaCl溶液的150 mL三角瓶中，转速160 r/min，振荡20 min后，制成均匀的土壤悬液。用10倍稀释法依次配制10-1～10-6的浓度梯度样液，取10-4、10-5、10-6 3个浓度梯度的样液，用于分离解钾菌。每次每个浓度样液吸取100 μL，涂布于钾细菌富集培养基上，3次重复，28 ℃培养2 d左右。挑取圆形、透明、表面湿润黏稠的大型菌落，进行平板划线纯化，反复进行 3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养，用LB斜面培养基4 ℃保存并做好标记。

解钾菌的复筛摇瓶培养： 将种子液按5% 接种量接种到50 mL/250 mL解钾复筛培养基，30 ℃ 180 r/min摇床培养7 d。设加等量灭活种子液的对照处理，每个处理3个重复。再用解钾菌筛选培养基进行复筛，进一步分离纯化解钾菌，挑选出长势较好的单菌落，进行保存并做好标记。

1.2.2 菌株解钾能力测定 将已灭菌的50 mL 解钾液体培养基及2 mL菌悬液（108 cfu/mL）加入300 mL 三角瓶中，160 r/min，30 ℃培养5 d，并设置不接菌液的空白对照组。培养液经1 000 r/min、4 ℃离心5 min，吸取4 mL上清液与4 mL 6 mmoL/L的LiCl充分混匀，采用原子吸收分光光度法测定待测菌株及空白组培养液的可溶性钾含量[13]。

1.2.3 菌株鉴定 （1）菌株形态观察：记录待鉴定菌株在钾细菌富集固体培养基上培养2 d的菌落特征，并观察其菌体形态特征。

（2）生理生化特征：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）及《常见细菌系统鉴定手册》[14]，进行细菌生理生化试验。

（3）16S rRNA 序列测定及分析：以待测细菌菌株基因组DNA为模板，选用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1 492R，进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30个，72 ℃10 min。将所得产物样品送至上海博尚生物技术公司测序，测序结果在NCBI中进行BLAST分析，利用EGA5.05软件，使用Neighbor-Joining法进行计算分析（Bootstraps=1 000），构建菌株系统进化树[15]。

1.2.4 功能菌株生长曲线测定 按5%的接种量将JT-K21菌液加入到解钾菌发酵培养基中，其中装液量为100 mL/250 mL，保证菌液浓度为108 cfu/mL。在160 r/min 30 ℃培养48 h，间隔4 h取样一次，测定培养样液的OD值。

1.2.5 不同碳氮源对菌株活性的影响 采用试验效果最佳的菌群组合，研究不同碳氮源对菌株活性的影响（增设对照组）。选取不同碳氮源进行液体培养实验，其中不同碳源为葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及甘露糖，不同氮源为酵母膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、蛋白胨。用原子分光光度法测定解钾菌培养液的可溶性钾含量，并测定菌体浓度OD值。

1.2.6 培养基正交试验 以上述碳氮源实验为基础，设计4因素3水平的正交试验。将解钾菌接种于装有已灭菌的100 mL解钾菌液体发酵培养基中，30 ℃ 160 r/min培养4 d。可溶性钾含量用原子分光光度法测定，同时测定菌体浓度OD值，以确定最优培养基成分配比。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0软件对实验结果进行方差分析和多重比较（LSD法和Duncan检验）等，并用Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 根际高效解钾细菌的分离、筛选

2.1.1 解钾菌的分离纯化 不同林龄（3、4、5、6、7、10年）的降香黄檀、檀香根际土壤，共纯化出可培养物89个。菌落呈近圆形或椭圆形、白色或灰白色、半透明或不透明、大部分边缘规则、生长速度中等。

2.1.2 菌株解钾能力测定 由表1可知，对照组的可溶性钾含量为41.31 μg/mL。可溶性钾含量在70 μg/mL以上的菌株有6株，解钾率在80%以上的菌株有3株，分别为菌株JT-K21、JT-K11及JT-K18，其中JT-K21培养液的可溶性钾含量最高，高达132.68 μg/mL，解钾率为221.18%。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株形态学观察 在钾细菌富集固体培养基上培养2 d，菌株JT-K21的菌落呈淡白色，不透明，表面光滑，扁平，边缘模糊，生长较快。JT-K21革兰氏染色均呈阴性，无芽孢，杆状，单个或成对排列，大小为（1.4～2.1）μm×（0.6～0.8）μm（图1～2）。

2.2.2 菌株生理生化 JT-K21具有运动性，可利用葡萄糖、蔗糖，过氧化氢反应、硫化氢试验、柠檬酸盐试验呈阳性，可水解明胶、淀粉，还原硝酸盐，其余生理生化测定指标见表2。结合形态学特征和生理生化指标，初步判断JT-K21属于假单胞菌科，假单胞菌属。

2.2.3 16S rRNA基因序列测定及分析 测序所得的功能菌株16S rDNA序列长度均在1 500 bp左右，将各菌株序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，同时与GenBank中的核酸数据进行对比分析，其中JT-K21与Pseudomonas putida（KF 831377）的同源性均达99%。筛选出有较高同源性的代表菌株，以各根际土壤功能菌的16S rRNA序列为基础，构建各自的系统进化树。JT-K21与假单胞菌属聚在同一族群，与Pseudomonas putida的遗传进化距离最近（图3）。综合各菌株的形态学特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析结果，初步鉴定菌株JT-K21为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。同时在GenBank中注册得到菌株JT-K21的16S rRNA基因序列登录号为KP216612。

2.2.4 菌株生长曲线 经光谱扫描，菌株JT-K21在660 nm处吸光值最大。由图4可知，培养12 h后，菌株JT-K12进入对数生长期，24 h后处于稳定期，培养40 h后转入衰退期，菌株JT-K21整体增长速度相对缓慢。

2.2.5 不同碳氮源对菌株的影响 由图5可知，解钾菌对蔗糖的吸收效果最好，此时培养液中菌体浓度及可溶性钾含量最高，而解钾菌对淀粉的吸收效果最差。说明同碳源对菌群活性产生不同的影响，结构简单的单糖更易于菌群吸收营养，从而更好地进行细胞代谢活动。

由图6可知，以铵盐（硫酸铵、氯化铵）为氮源时，更有利于菌群的营养吸收；硝酸盐（硝酸钠、硝酸钾）的吸收效果比有机氮源（酵母膏、蛋白胨）好；解钾菌JT-K21对硫酸铵的吸收效果最好，对蛋白胨的吸收效果最差。

2.2.6 培养基正交试验 由表3可知，各因素对解钾菌菌体浓度的影响程度，依次为蔗糖>硫酸铵>氯化钠>钾长石；若使解钾菌菌体浓度最大，则培养基的最优组合为蔗糖（10 g/L）、硫酸铵（0.2 g/L）、氯化钠（0.1 g/L）、钾长石（5 g/L）。各因素对解钾菌发酵液中可溶性钾含量的影响程度，依次为蔗糖>硫酸铵>钾长石>氯化钠；若使解钾菌发酵液中可溶性钾含量最大，则培养基的最优组合为蔗糖（10 g/L）、硫酸铵（0.2 g/L）、氯化钠（0.1 g/L）、 钾长石（3 g/L）。综合考虑，在解钾菌K21的菌体浓度最大化的基础上，提高其解钾活性，故最终选择最优组合（L2）。

3 讨论与结论

根际解钾菌不仅可以改良土壤结构、降解有毒物质，还可以促进植物生长、防治植物病害[16-17]。目前有关与解钾菌的解钾机制，大部分研究认为解钾菌通过分泌酸性代谢物来酸溶及络合难溶性矿物质，导致晶格结构被破坏，使得钾、磷等元素游离出来[18-19]，调节土壤理化性质，从而改良土壤结构。而另一部分研究发现解钾微生物通过分泌酸性物质分解硅酸盐中的Si-O-Si键，破坏晶体结构，使得钾、镁等元素游离[20]。

近年来有研究表明，包括根际解钾菌在内的根际土壤功能菌诱导植物产生生长激素、增强植物对环境的忍耐力及对病原菌的抗性[21-22]，以达到促生防病的作用。虽然解钾菌有改良土壤环境、促生防病等作用，但由于气候、土壤类型及理化结构、植物品系的不同，使得从植物根际土壤分离出的解钾菌的解钾能力存在较大差别。如盛下放等[23-24]分离筛选的解钾硅酸盐细菌NBT 菌株，其释钾量较对照增加了226.0%；而李新新等[25]从江西红壤中筛选到一株类芽孢杆菌属的解钾菌株G4，其解钾效率为27.62%。本研究结果发现，解钾率在80%以上的菌株有3株（菌株JT-K21、JT-K11、JT-K18），而菌株JT-K21解钾率达到221.18%。JT-K21的最佳培养基组分为蔗糖10 g/L，CaCO3 5.0 g/L，Na2HPO4 0.2 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L， MgSO4·7H2O 0.3 g/L， NaCl 0.2 g/L， CaSO4·2H2O 0.2 g/L， 钾长石粉（150 目）5 g/L，去离子水。下一步将对菌株JT-K21的液体发酵条件进行研究，以便降低大规模发酵生产成本，有利于专用生物复合肥的推广与应用，从而改善人工种植降香黄檀、檀香的根际微生态环境。

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