响应面法优化近江牡蛎多糖提取工艺

牛改改 游刚 张晨晓 余振宁

摘要：【目的】优化近江牡蛎多糖提取工艺，为不同海域牡蛎多糖含量对比及其结构分析打下基础。【方法】以近江牡蛎为原料，通过单因素试验考察液料比、提取温度、提取时间、提取次数4个因素对其多糖提取率的影响，并在此基础上选取液料比、提取时间及提取温度3个因素为变量，近江牡蛎多糖提取率为考察指标，采用Box-Behnken试验设计方法建立回归模型，以优化近江牡蛎多糖提取工艺条件。【结果】通过响应面法建立近江牡蛎多糖提取率（Y）与液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）的二次多项式数学模型为：Y=9.65-0.18A-0.071B+0.080C-0.27AB-0.24AC-0.52BC-2.6A2-1.34B2-1.35C2，该模型拟合度好；最佳提取工艺条件为：液料比90∶1、提取温度90 ℃、提取时间3 h、提取次数1次，在此条件下的近江牡蛎多糖提取率为9.72%，与预测值（9.66%）相对偏差为0.62%。【结论】采用响应面分析法优化近江牡蛎多糖提取工艺具有可行性，可用于实际生产，以提高多糖提取率。

关键词： 近江牡蛎；多糖；响应面分析；提取工艺优化

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-0994-07

0 引言

【研究意义】牡蛎（Ostrea gigas thunberg）是分布于温带和热带海域的双壳類海洋软体动物（王俊等，2006）。近江牡蛎（Ostrea rivularis Gould）是牡蛎中的一种，其肉质细腻，气味芬芳，富含微量元素、蛋白质、牛磺酸、多糖等多种营养成分（张聪等，2009；吉宏武等，2010；田振华等，2013），具有降血脂、促进新陈代谢、改善高血糖症状、提高免疫力等功效，对抗癌和防止癌细胞扩散也有一定效果（张艳军等，2012；Yang et al.，2013）。其中，牡蛎多糖具有增强机体细胞免疫和体液免疫功能、抗白细胞下降、抗肿瘤、抗血栓、降血脂等药用价值（蒋杨，2013）。广西北部湾沿海天然近江牡蛎资源丰富，主要分布于茅尾海海域附近（李翠等，2013；钟方杰等，2014）。因此，充分利用地理优势，研究近江牡蛎多糖提取工艺，对其药用开发与利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外已有不少学者对牡蛎多糖的提取工艺进行研究。张艳军等（2012）采用正交试验对茅尾海海域近江牡蛎多糖提取工艺进行优化，确定水提取多糖的工艺参数为：pH 6、提取时间5 h、提取次数3次、水浴温度75 ℃，在此条件下多糖提取率为2.56%。张硕和张崇禧（2012）采用星点设计—响应面法优化山东威海牡蛎多糖的提取工艺条件，在料液比1∶80、水浴温度81 ℃的条件下提取2.9 h，得到多糖提取率为8.45%。田振华等（2013）采用正交试验优化得到牡蛎多糖提取条件为：pH 8.0、温度65 ℃、时间4 h、次数3次、料液比1∶15，在此条件下的多糖提取率为2.71%。Cai等（2014）采用超声波辅助酶解法提取巨牡蛎多糖，并通过单因素试验和响应面设计优化多糖提取工艺，得到多糖提取率为7.03%。【本研究切入点】响应面法是一种合理的试验设计方案，可通过建立多元二次回归数学模型，实现提取工艺参数优化并预测响应值的目的（李璐等，2014；任雪峰等，2014）。目前，利用响应面法优化近江牡蛎多糖提取工艺，并提高多糖提取率的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以近江牡蛎为原料，考察提取温度、提取时间、液料比、提取次数对近江牡蛎多糖提取率的影响，利用Box-Benhnken响应面法对相关参数进行优化，确定最佳提取工艺，以提高近江牡蛎多糖提取率，为不同海域牡蛎多糖含量对比及其结构分析打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

新鲜近江牡蛎采自广西北部湾茅尾海海域。葡萄糖、98%硫酸、无水乙醇、苯酚、乙醚、丙酮等试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。pH 7.2磷酸缓冲液：取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液50 mL与0.2 mol/L氢氧化钠溶液35 mL，加新沸过的冷水稀释至200 mL，摇匀即得。主要仪器设备：DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）、FA1004电子分析天平（上海楚柏实验室设备有限公司）、数显鼓风干燥箱101-3A（绍兴市沪越科学实验仪器厂）、LD4-2A离心机（上海梅香仪器有限公司）、DF-1型集热式磁力搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、HHS-1型电热恒温水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1. 2 近江牡蛎粗多糖制备

称一定量去壳的新鲜近江牡蛎，匀浆后用等量的丙酮和无水乙醇溶液分别浸泡12和4 h，滤除有机相后加入pH 7.2磷酸缓冲液，水浴提取，过滤后离心，取上清液浓缩，用3倍体积的95%乙醇醇沉24 h，离心后取沉淀冷冻干燥，所得干粉即为近江牡蛎粗多糖，放入干燥器中备用。

1. 3 葡萄糖标准曲线绘制

参考刘军海等（2009）的方法，准确称取20 mg葡萄糖标准品，置于500 mL容量瓶中定容，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL置于锥形瓶中，以蒸馏水补足至10.0 mL，加入5.0 mL浓硫酸和1.0 mL 80%苯酚溶液，摇匀，冷却至室温后放置20 min，于490 nm处测吸光值。另以10.0 mL水溶液作空白对照。以葡萄糖用量为横坐标、吸光值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

1. 4 近江牡蛎多糖含量测定

参考陈丽等（2012）的方法，取一定量近江牡蛎干粉，在一定液料比、提取温度、提取时间的条件下提取多糖，采用苯酚—硫酸法测定吸光值后，再根据葡萄糖标准曲线计算近江牡蛎多糖提取率。

多糖提取率（%）=X×（M/m）/A×10-6×100

式中，X为通过标准曲线计算出的多糖溶液中多糖质量（μg）；M为近江牡蛎样品制成的近江牡蛎干粉质量（g）；m为提取时取用的近江牡蛎干粉质量（g）；A为去壳近江牡蛎样品质量（g）。

1. 5 单因素试验设计

1. 5. 1 液料比对近江牡蛎多糖提取率的影响 准确称取1 g近江牡蛎醇沉多糖干粉5份，以水为提取溶剂，在提取温度80 ℃、提取时间2 h的条件下，研究不同液料比（60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1）对近江牡蛎多糖提取率的影响。

1. 5. 2 提取时间对近江牡蛎多糖提取率的影响 准确称取1 g近江牡蛎醇沉多糖干粉5份，以水为提取溶剂，在液料比80∶1、80 ℃条件下分别水浴提取1、2、3、4和5 h，离心，取上清液，测定近江牡蛎多糖含量，研究不同提取时间对近江牡蛎多糖提取率的影响。

1. 5. 3 提取温度对近江牡蛎多糖提取率的影响 准确称取1 g近江牡蛎醇沉多糖干粉5份，以水为提取溶剂，液料比80∶1，分别在60、70、80、90和100 ℃下水浴提取2 h，离心，取上清液，测定近江牡蛎多糖含量，研究不同提取温度对近江牡蛎多糖提取率的影响。

1. 5. 4 提取次数对近江牡蛎多糖提取率的影响 准确称取1 g近江牡蛎醇沉多糖干粉5份，以水为提取溶剂，在液料比80∶1、90 ℃的条件下提取3 h，重复上述操作，分别提取1、2和3次，研究不同提取次数对近江牡蛎多糖提取率的影响。

1. 6 响应面分析法试验设计

以单因素试验为依据，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理（张凯渊等，2006），选取对近江牡蛎多糖提取率有较大影响的液料比、提取时间、提取温度3个因素，设计3因素3水平的响应面分析试验方案，以优化近江牡蛎多糖提取工艺。响应面因素与水平见表1。

1. 7 统计分析

采用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析，Duncans多重比较进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚—硫酸比色法测定不同质量浓度葡萄糖标准溶液的吸光值，以吸光值对葡萄糖用量绘制标准曲线（图1），并进行线性回归，得标准曲线方程：y=0.00025x+

0.00518（R2=0.99932），该标准曲线线性关系良好。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 液料比对近江牡蛎多糖提取率的影响 由图2可知，液料比为60∶1～90∶1时，随着液料比的增大，近江牡蛎多糖提取率逐渐升高，且增加速率较快；液料比超过90∶1后，多糖提取率增加缓慢，于100∶1时达最大值。液料比过高，会使溶出性杂质增多，竞争性抑制多糖溶解，且液料比为100∶1时的多糖提取率与液料比90∶1的多糖提取率相差小，考虑到节约成本，故选择90∶1为最佳液料比。

2. 2. 2 提取时间对近江牡蛎多糖提取率的影响 由图3可知，近江牡蛎多糖提取率随提取时间的延长先升高后降低，当提取时间为3 h时，多糖提取率达最大值，之后牡蛎多糖提取率随提取时间的延长反而下降。提取时间过短，近江牡蛎多糖未充分溶出；提取时间过长，会使其他可溶性杂质溶出，抑制多糖的溶解，综合考虑节约时间与成本，选择3 h为最佳提取时间。

2. 2. 3 提取温度对近江牡蛎多糖提取率的影响 由图4可知，近江牡蛎多糖提取率随提取温度的升高呈先升高后降低的变化趋势，当提取温度升至90 ℃时，多糖提取率达最大值，之后多糖提取率随着提取温度的继续升高而快速降低。这可能是由于提取温度升高，使得细胞组织软化，细胞壁破坏，多糖溶出速度加快；但提取温度过高，会引起部分多糖分解，近江牡蛎中蛋白质等物质变性，增加多糖溶出的阻力，从而导致多糖提取率降低。因此，选择90 ℃为最佳提取温度。

2. 2. 4 提取次数对近江牡蛎多糖提取率的影响 由图5可知，随着提取次数的增加，近江牡蛎多糖提取率由8.71%增至9.21%。近江牡蛎样品提取1次的多糖提取率占提取3次多糖提取率的94.79%，且提取2次仅比提取1次得到的多糖提取率增加2.75%，提取3次比提取2次得到的多糖提取率增加2.68%，提取率增加不明显。提取次数的增加虽能提高多糖提取率，但提高幅度过小，综合考虑到节省时间与提高提取效率，在近江牡蛎多糖提取过程中，提取1次即可。

2. 2. 5 各因素与多糖提取率的方差分析 利用SPSS 19.0对不同提取条件的近江牡蛎多糖提取率进行方差分析，结果如表2所示。由表2可知，提取温度、提取时间、液料比及提取次数对近江牡蛎多糖提取率均有极显著影响（P<0.01，下同），但提取次数的影响相对较小。

2. 3 模型方程的建立与显著性分析

采用Design-Expert 8.0.6对响应面试验结果（表3）进行回归拟合，得到以近江牡蛎多糖提取率为响应值（Y），以液料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）为因素变量的二次多项回归方程：Y=9.65-0.18A-0.071B+

0.080C-0.27AB-0.24AC-0.52BC-2.6A2-1.34B2-1.35C2。

回归方程中各变量对近江牡蛎多糖提取率影響的显著性经方差分析，结果如表4所示。由表4可知，回归模型P<0.01极显著，失拟项P>0.05不显著，相关系数R2=50.20/50.35=0.997，表明该模型具有极显著的统计学意义，误差较小，拟合度好，适用于近江牡蛎多糖提取工艺的优化。方程中的AB、BC、A2、B2、C2对近江牡蛎多糖提取率影响极显著，A和AC影响显著（P<0.05，下同），B和C影响不显著（P>0.05）；表明各因素对结果的影响并非简单的线性关系，二次项与交互项均对结果影响较大。P越小则相应变量对结果影响的显著性越高，因此，影响近江牡蛎多糖提取率的显著性顺序为：液料比>提取温度>提取时间。

2. 4 因素间交互作用分析

在3D响应面图中，响应值随着因素的增加变化越大，即斜面的倾斜度越大，说明该因素对响应值的影响越显著；在等高线中，两两因素构成的等高线越像椭圆形，说明这两种因素对响应值有交叉影响。由图6～8可知，两两因素间的等高线图均为椭圆形，说明不同因素间对近江牡蛎多糖提取率均有交叉影响。从图6可以看出，随着提取时间的延长和液料比的增大，近江牡蛎多糖提取率呈先上升后下降的变化趋势，但多糖提取率沿液料比方向增加速率较大，沿提取时间方向增加速率较小，说明近江牡蛎多糖提取率受液料比的影响较显著；从图7可以看出，随着液料比的增大和提取温度的升高，近江牡蛎多糖提取率也呈先上升后下降的变化趋势，但多糖提取率沿液料比方向的变幅明显大于提取温度方向，说明液料比对近江牡蛎多糖提取率的影响比提取温度显著；从图8可以看出，近江牡蛎多糖提取率随着提取温度的升高和提取时间的延长，也呈现先上升后下降的变化趋势，但多糖提取率沿提取温度方向的增幅较大，而沿提取时间方向的增幅相对较小，说明提取温度对近江牡蛎多糖提取率影响比提取时间显著。

2. 5 最佳提取工艺的验证试验结果

由Design-Expert 8.0.6分析得到的近江牡蛎多糖最佳提取工艺为：液料比90∶1、提取温度90 ℃、提取时间3 h、提取次数1次，预测多糖提取率为9.66%。经验证试验，最佳提取工艺条件下的多糖提取率为9.72%，与预测值相对偏差为0.62%，说明该模型具有一定的适用性，采用响应面法优化近江牡蛎多糖提取工艺具有可行性。

3 讨论

目前提取多糖常用的方法有溶剂浸提法、酶提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等。其中，溶剂浸提法是最传统的提取方法，虽然提取时间较长，但具有工艺简单、便于企业大规模生产等优点。本研究以水为提取溶剂，在单因素试验的基础上，采用3因素3水平的响应面分析法优化近江牡蛎多糖的提取工艺，得到最佳的提取工艺条件为：液料比90∶1、提取温度90 ℃、提取时间3 h，经验证得到近江牡蛎多糖提取率为9.72%，与理论预测值9.66%基本一致，较张艳军等（2012）、田振华等（2013）采用正交试验优化提取工艺得到的牡蛎多糖提取率高。在实际生产中，若采用本研究优化的近江牡蛎多糖提取工艺参数，可极大提高生产率。

响应面法不仅能确保理论预测值与试验实际值偏差小，还可分析各影响因素之间的交互作用。本研究结果表明，液料比与提取时间、提取时间与提取温度的交互作用对近江牡蛎多糖提取率有极显著影响，液料比、液料比与提取温度的交互作用对近江牡蛎多糖提取率有显著影响，与张硕和张崇禧（2012）的研究结果不完全一致，可能与试验材料分布在不同海域有关。

孔祥会等（2008）的研究结果表明，锯缘青蟹中可溶性多糖含量随季节的不同而发生变化。本研究采用的原料为北部湾茅尾海海域的近江牡蛎，其环境条件也是动态变化，下一步将对可能影响牡蛎多糖含量变化的因素（海域、季节、贮藏阶段）进行研究，以期为牡蛎多糖的开发利用提供更多科学依据。

4 结论

本研究通过响应面分析法优化近江牡蛎多糖提取工艺，得到最佳工艺条件为：液料比90∶1、提取温度90 ℃、提取時间3 h、提取次数1次，在此条件下的近江牡蛎多糖提取率为9.72%，与预测值（9.66%）相对偏差为0.62%。表明采用响应面分析法优化近江牡蛎多糖提取工艺具有可行性，可用于实际生产，以提高多糖提取率。

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（责任编辑 罗 丽）