艾草（Artemisia argyi）单萜合成酶基因的克隆及序列分析

刘雷　 罗英　陶红　姜立春　徐应文　刘群　黄坤

摘 要 利用RACE技术从艾草（Artemisia argyi）的成熟叶片中克隆了萜类化合物生物合成的单萜合成酶（TPS）的基因，并对其进行序列特征分析和系统进化关系预测。结果表明，该基因cDNA全长为1.7 kb，开放阅读框可编码538个氨基酸残基，并包含与其功能高度相关的DDxxD保守区和RR（degenerated RRx8W）保守区。预测的AaTPS二级结构具有28个转角，30个α螺旋，8个β折叠。预测的三维结构符合单萜合酶的立体构象。系统发育分析表明，AaTPS基因与其他双子叶植物中的单萜合酶基因聚为一类，与菊科植物的单萜合酶基因相似性较高。

关键词 艾草；单萜合酶基因；系统发育分析

中图分类号 S567.23；Q78 文献标识码 A

Abstract To obtain the indispensable key enzyme involved in the monoterpene biosynthesis， the monoterpene synthase gene（TPS）was cloned and analyzed from Artemisia argyi through RACE. Results showed that the clones of cDNA were 1.7 kb on average， and contained an open reading frame（ORF）predicting a polypeptide of 538 amino acids（aa）， with a transit peptide and highly conserved DDxxD motif and RR（degenerated RRx8W）motif. Prediction of secondary structure and subcellular localization suggested that the protein might be encoded by AaTPS containing 28 coils， 30 alpha helixes， and 8 beta strands. The prediction of the three-dimensional structure conformed to spatial conformat of monoterpene synthase. Phylogenetic analysis indicated that AaTPS grouped with other dicotyledonous plant mono-TPS， and subgrouped in the composite family.

Key words Artemisia argyi； Monoterpene synthase； Phylogenetic analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.017

艾草（Artemisia argyi）又名香艾、艾蒿，为菊科蒿属多年生草本植物。具有散寒止痛、温经止血、平喘镇咳、止血祛痰、镇静免疫等功效[1-3]，对疟疾、肝炎、癌症、过敏和炎症等症状都有良好的治疗效果，并且能抑制由真菌、细菌和病毒等引起的传染疾病的发生和传播[4-5]。除药用价值外，艾草因其独特的芳香气味，深受人们喜爱，常用于制作糕饼、炒菜、炖汤等，同时对降血压、降血脂、缓解心血管疾病均有较好的食疗作用，是一种典型的保健蔬菜[6]。随着科学技术的普及、生活水平的提高和生活质量的改善，人们的健康意识和环境意识日益增强，纯天然的药物和功能性食品越来越受到广大消费者的青睐[7]。艾草作为广为流传和应用广泛的药用植物，其研究开发利用蕴藏着巨大的经济效益和良好的社会效益。

艾草富含挥发油，其中以单萜类化合物最为丰富，是重要的香味物质[8-13]，具有良好的药用活性和抗菌效果[14-17]。植物单萜类成分在医药、工业、农业等方面有着广泛的用途，是植物挥发油中极具价值的部分[8-9]。同时，单萜也是一类重要的防御性次生代谢产物，在抗病、抗虫、耐旱、防紫外线等方面发挥着重要的作用[18-20]。

单萜合酶（monoterpene synthases， mono-TPS）是单萜生物合成过程中的关键酶，其作用是将单萜类化合物的共同前体物质香叶基焦磷酸（Geranyl diphosphate， GPP）环化成立体化学构象各异的单萜类化合物[18-19]。自Colby等[21]从留兰香（Mentha spicata）中克隆到第一个4S-柠檬烯合酶基因以来，现已获得了几十个物种上百个单萜合酶基因，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）[22]、玉米（Zea mays L.）[23]、芒果（Mangifera indica L.）[24]、番茄（Lycopersicon esculentum）[25]等。这些成果主要以美国、德国、加拿大、日本等发达国家为主，而国内仅在青蒿[26-27]、 檀香[28]、赤桉[29]等物种上有一些研究。单萜合酶基因进化频率高，而目前分离得到的基因涉及物种较少，需要克隆更多基因以全面认识单萜合酶系统发育和功能进化。因此，mono-TPS早已成为科研工作者的关注焦点[30]。

先前对艾草的研究主要集中在有效化学成分的提取、分离及活性研究上[8-17]。对艾草挥发油积累机理未见报道。由此，本研究拟从艾草中克隆得到关键酶艾草单萜合酶基因，并进行生物信息学分析，为了解艾草单萜生物合成的分子机制，调控艾草单萜类化合物的产量以及提高艾草综合利用价值奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用艾草（Artemisia argyi H. Lév. & Vaniot）的成熟叶片作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及反转录 采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Labgene Biotechnology Co.， Ltd.）提取总RNA，利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Bio Inc.）进行反转录获得第一链cDNA。

1.2.2 基因保守片段的克隆 根据NCBI上其他植物mono-TPS基因保守区域，设计引物PF1：5′-GAATTTAGCAGCATTCAACT-3′和PR1：5′-CATTT

CCATGACATGCTCACG-3′； PCR反应总体积为50 μL，1.5 mmol/L MgCl2，4种dNTPs各200 μmol/L，引物各150 ng，1.5 U Taq plus DNA polymerase，100 ng cDNA。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR产物回收后与pGEM-T easy Vector 连接，连接产物转化E. coli JM109 感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆，筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得BbTPS基因片段。

1.2.3 3′ RACE克隆 采用SMART RACE cDNA amplification kit（Clontech Laboratories， Inc.），扩增目的基因的3′末端。取4 μL总RNA作为模板，用

3′-CDS primerA（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA

GTAC（T）30VN-3′）逆转录合成3′-RACE ready cDNA作为3′-RACE模板。以下游通用引物和每个基因的3′特异引物进行降落PCR扩增。降落PCR反应程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环，94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环，72 ℃ 8 min。3′ RACE PCR产物亚克隆入pMDl8-T载体（TaKaRa Bio Inc.），测序。

1.2.4 5′ RACE克隆 根据所获得的保守区域的序列，利用SMART RACE cDNA amplification kit 扩增目的基因的5′末端。4 μL总RNA作为模板，用5′-CDS primer A（5′-（T）25VN-3′）逆转录合成5′ -RACE ready cDNA作为5′ RACE模板。以UPM和e15rcl87为引物进行第一轮降落PCR：上游通用引物UPM（Universal Primer Mix）。反应结束后，取PCR产物1 ∶ 100稀释作为模板，以NUP和基因5′ RACE特异引物进行巢式降落PCR。上游通用引物mNUP下游基因特异性引物5′ RACE2两轮降落PCR反应程序均同上。5′ RACE PCR产物亚克隆入pMDl8-T载体，测序。

1.2.5 全长cDNA的克隆 根据对3′/5′端序列以及基因片断的序列比对发现，艾草AaTPS基因各个拷贝均能很好的匹配，进行电子拼接，得到艾草AaTPS基因全长cDNA序列，然后分别以起始密码子上游和端终止子下游区域设计特异引物（上游引物：CTTTATCAAACCGAGTTATGGAGG；下游引物：CTTGGTGAGTTGGATTTTTCTTC），扩增得到基因编码区全长cDNA序列。扩增体系、反应程序、亚克隆及测序等同5′-RACE。

1.2.6 序列分析 引物设计使用Primer 5.0完成；氨基酸序列翻译、比对及亲/疏水性在DNAMAN软件（version 4.0，Lynnon Biosoft，Quebec）中进行分析。在丹麦技术大学生物序列分析中心（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）分别使用TMHMM、SignalP、TargetP程序分别对信号肽切割位点、亚细胞定位进行预测分析。在DNAstar软件中对艾草AaTPS基因进行二级结构预测。多重比对在Clustal X1.83 软件中进行，参数为默认，分析保守区的组成及变化规律。将序列比对结果输出至MEGA4软件中，并利用MEGA4构建系统发生树，方法为邻近法（Neighbor-joining method， NJ）。进化分支上的置信度通过500次自展重复计算获得[20]。

2 结果与分析

2.1 艾草AaTPS cDNA序列分析

通过其他植物单萜合酶基因保守区设计的引物，扩增得到约600 bp的DNA序列，预计包含200个氨基酸残基，通过比较该序列与NCBI中其他植物序列发现，与其他植物中单萜合酶基因的序列相似性较大。在编码区设计特异引物，通过3′ RACE和5′ RACE技术，获得基因片段的两端侧翼序列，并进行拼接。再从开放阅读框两端设计引物，获得该基因的全长编码区序列，总长度1 742 bp，包含1 614 bp的开放阅读框，编码538个氨基酸序列残基，分子量约为62.254 ku（图1）。

2.2 氨基酸序列分析

对艾草AaTPS基因氨基酸序列进行分析，结果发现，该氨基酸序列包含538个氨基酸残基，分子量约为62.254 ku。通过与其他植物的单萜合酶的多重序列比对发现，艾草AaTPS与其他植物TPS基因相似度在54%左右。艾草AaTPS氨基酸序列中包含与其功能密切相关的保守区DDxxD和保守区RR（图2）。

2.3 系统进化分析

通过对AaTPS基因与其他物种相关基因建立系统进化树，结果发现，所有植物类单萜合酶可分为两大类，即单子叶植物类和双子叶植物类。另外，还可以发现，来自相同科、或属的植物被聚在一起，如Fragaria vesca， Fragaria vesca subsp， Fragaria x ananassa， Rosa rugosa， Malus domestica and Prunus persica。艾草单萜合酶AaTPS被聚在双子叶植物类中，与Actinidia arguta， Actinidia chinensis， Antirrhinum majus and Solanum lycopersicum等植物一起组成一个亚类（图3）。

2.4 蛋白质高级结构分析

对艾草AaTPS氨基酸序列二级结构进行预测。结果表明AaTPS包含28个转角，30个α螺旋，8个β折叠（图4）。亲水性分析结果表明AaTPS氨基酸序列以疏水性区域为主。根据亲水区/疏水性区分布情况，AaTPS氨基酸序列可分为三大区域，即由疏水性氨基酸区段主导的N端、由亲水性氨基酸和疏水性氨基酸交替分布的C端前端、由疏水氨基酸区段主导C端末端（图4）。这种亲/疏水性区段分布可能与催化中心所执行亲电催化机理有着密切相关。

基于鼠尾草单萜合酶的晶体结构模型成功预测到艾草AaTPS的三维结构。根据QMEAN4 综合分值判断其预测结果较为理想，其模型近似于真实AaTPS立体结构。立体构象结果表明，携带氨基酸保守区DDXXD（氨基酸序列中的287-291aa）的核心催化区位于该酶的功能域中心，以保守区RR为核心的N端保护区域倒扣在核心催化区外围，从而对亲电催化环境形成保护作用。这也反映了DDXXD和RR两大保守区在单萜合酶催化功能中的重要性（图5）。

3 讨论

本研究成功从艾草中克隆到单萜合酶基因，但其催化功能有待进一步研究。以上序列分析结果表明，该基因对应的氨基酸序列具备几乎所有单萜合酶都具有两大典型保守区，即位于C端的富含天冬氨酸的保守性结构“DDXXD”和位于N端的富含精氨酸的“RRx8W”保守区[19]。同时，聚类分析表明，该酶与来源于其他双子叶植物Actinidia arguta，Actinidia chinensis，Antirrhinum majus and Aolanum lycopersicum的单萜合酶聚在一个亚类。经预测，该酶的二级折叠结构，三维立体结构以及亲水性/疏水性区域分布完全符合单萜合酶的基本特征。因此，可以初步判断本研究获得的基因编码单萜合酶。然而，有研究表明，相同功能的单萜合酶基因在序列上有可能千差万别，而相同物种来源的不同单萜合酶基因间的相似性往往高于不同物种来源而具有相同功能的单萜合酶[31-38]。因此，基于本研究所获得的序列信息还无法判定该酶催化产物的单萜种类。后续研究需通过基因工程方式获得该酶的重组蛋白，建立以GPP为底物的催化体系，测定其催化产物的单萜种类，从而确定该酶属于哪一种单萜合酶。

该酶的催化产物可能包含环状单萜。植物单萜合酶的N端精氨酸保守区域RRx8W除了有维护C端核心催化区域的疏水环境外，还有重要的环化异构功能[37]。前人研究表明，催化产生环状单萜柠檬烯的单萜合酶，被人为改造去掉RRx8W保守序列后，催化产物就只有链状单萜而没有环状单萜。当然，在自然界中也一些单萜合酶丢失了RRx8W保守区，尽管这种现象极为罕见，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）沉香醇合酶，催化产生的多种单萜中同样没有链状单萜[38]。虽然本研究获得的艾草单萜合酶的RRx8W保守区域已退化成两个RR残基，但是前人研究发现在一些RRx8W保守区退化成RR的植物单萜合酶，其催化产物中仍然有部分环状单萜产生[37]。因此，推测艾草单萜合酶可能具有同样的环化能力。由于环状单萜可形成的空间构象变化较链状单萜更为丰富，因此这一能力将使艾草获得更多不同生理生态意义的单萜物质，进而在对食草动物产生拒食效果、抗氧化、抵御病害方面发挥重要作用。

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