茶树EGCG合成过程相关的Ankyrin基因的克隆与表达分析

郑世仲　林玉玲　孙平　赖钟雄　林金科

摘 要 运用RACE技术，从茶树新品系“1005”嫩芽中克隆出Ankyrin基因全长cDNA（2 034 bp），5′UTR和3′UTR分别为353 bp和55 bp，编码541个氨基酸，命名为CS-Ankyrin。基因全长序列在线blast比对分析结果表明，该基因与葡萄、蓖麻、可可和杨树的Ankyrin序列的一致性分别为78%、78%、77%和77%。生物信息学分析显示，CS-Ankyrin锚蛋白重复序列是由5个ANK单元组成，该蛋白是定位在质膜上起作用的跨膜疏水蛋白，但疏水性较差；系统进化树分析表明，该基因编码的氨基酸与芝麻的亲缘关系最为接近。比较CS-Ankyrin在不同发育阶段叶片的表达和EGCG含量变化结果表明，CS-Ankyrin基因在3个品系不同样品的表达趋势与其EGCG含量变化趋势一致，芽头>二叶>四叶；亚细胞定位试验结果表明，CS-Ankyrin蛋白定位在细胞膜上起作用。推测该蛋白可能参与EGCG的储存和跨膜运输。

关键词 茶树；锚蛋白重复序列；生物信息学；EGCG；亚细胞定位

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Abstract The full-length cDNA（2 034 bp） of one Ankyrin gene named CS-Ankyrin was cloned from the Camellia sinensis“1005”using RACE technique， which encoding a 541 amino acid protein. Bioinformatics analysis showed that， with low hydrophobicity， the encoded protein consisting of 5 ANK was hydrophobic and functioned in plasma membrane. Phylogenenetic analysis showed that the protein encoded by CS-Ankyrin had the closest genetic relationship with that in Sesamum indicum. Comparing the expression level of CS-Ankyrin and the EGCG content at different developmental stages of three cultivars， CS-Ankyrin expression was observed to vary with a similar trend observed for each cultivar： bud>the second leaf>the fourth leaf. The changes in EGCG was also found to follow a similar trend to that for gene expression. The subcellular localization results showed that the protein was located in the cytomembrane. We speculate that the protein is related to storage and transmembrane transport of EGCG.

Key words Camellia sinensis；Ankyrin repeat；Bioinformatics；EGCG；Subcellular localization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.015

EGCG（Epigallocatechin gallate）是茶叶品质的关键核心成分之一，也是茶多酚中最有效的活性成分，为类黄酮化合物，具有很强的抗氧化、抗癌、抗辐射、抗糖尿病、抗高血脂等功效[1-4]。因此，EGCG在食品加工、医药、化工等领域具有广阔的应用前景。EGCG可以作为食品添加剂或者开发为功能性食品，有研究也表明，EGCG在食品体系中也可以发挥很强的抗氧化效果，抗氧化能力比VE还强[5]。喝茶，特别是高EGCG茶对于提高肌体免疫能力、抗衰老、抗癌、降血脂、预防糖尿病等都具有很好的保健作用[2，6-9]，不同茶树品种发育程度不同的茶树新梢芽叶，EGCG的含量不尽相同，虽然有关类黄酮化合物生物合成的基本途径已经探明[10-11]，相关产物的组分变化也有相关报道[12]，但EGCG生物合成的分子机制仍然比较模糊。茶树类黄酮化合物生物合成的一些结构基因已经被分离鉴定，如PAL（Phenylalanine Ammonialyase）、 ANR（Anthocvanidin Reductase）、 ANS（Anthocyanidin Synthase）、 DFR（Dihydro Flavonol 4-reducta）、 CHS（Chalcone Synthase）、 CHI（Chalcone Isomerase）、 F3H（Flavanone 3-hydroxylas）、 LAR（Leucoanthocyanidin Reductase）等[13-15]，但决定茶树EGCG生物合成的关键基因还未完全明确。

1987年，Breeden和Nasmyth在2个酵母细胞周期调控蛋白中发现了锚蛋白重复（ankyrin repeat，ANK）序列模体。锚蛋白重复序列普遍存在于真核、原核及病毒中，主要功能是介导蛋白质间的相互作用[16-17]。各个ANK蛋白中ANK的数目、一级序列及其空间结构上均有差异，因此ANK模体能够和不同的蛋白质配体结合，从而实现功能的多样化，包括形成细胞骨架的完整性、参与植物自身的防疫、生物体的生长发育、物质的合成与运输。目前，关于锚蛋白重复序列的研究主要集中在动物体，植物锚蛋白的研究相对较少，只在拟南芥、烟草和水稻等模式植物中有报道[18]，茶树中有关锚蛋白重复序列的研究还未见报道。

本课题组经过前期的实验研究，以高EGCG茶树新品系“1005”及其父母本黄旦和福云七号为材料，并利用高通量测序技术和相关软件分析，筛选出了与茶树EGCG生物合成密切相关的若干基因，Ankyrin基因是其中一个关键基因。本研究拟利用RACE技术，以“1005”新品系嫩芽为材料，在相关的转录组数据库的基础上克隆出Ankyrin基因全长序列，并对该基因及其编码蛋白进行相关生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR技术分析该基因在父母本和子代“1005”品系中的表达差异，确定该基因在子代及父母本的表达特性，并与EGCG含量的变化规律进行对比，分析基因表达变化与EGCG含量变化的相关性；通过与报告基因GFP融合构建表达载体进行亚细胞定位分析，从而为进一步研究茶树EGCG代谢合成的分子机制及其调控机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料来自福建省高校农业生物技术重点实验室选育的茶树新品系“1005”，及普通茶树黄旦（父本）和福云7号（母本）。采摘芽、二叶、四叶作为样品。所有样品分为2份，一份干燥后用于EGCG含量测定，一份立即放入液氮中，并保存在-80 ℃的冰箱，用于总RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 参照TransGen Biotech公司的 TransZolTM Up Plus RNA Kit的试剂盒提取“1005”新品系芽头总RNA，并保存于-80 ℃。采用Fermentas公司的Rever-tAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂盒方法合成第一链cDNA。按照Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成第一链cDNA用于5′-RACE和3′-RACE的剿式PCR扩增。

1.2.2 茶树CS-Ankyrin基因的克隆 参照本课题组获得的茶树相关转录组数据库中已知的CS-Ankyrin部分序列，以“1005”品系嫩芽总RNA逆转录的第一链cDNA为模板，利用DNAMAN6.0软件设计上下游引物Ank-F和Ank-R，验证扩增CS-Ankyrin基因部分cDNA序列。利用测序结果得到的序列，分别设计用于扩增CS-Ankyrin cDNA3′末端序列引物Ank3′-1和Ank3′-2，5′末端序列的引物Ank5′-1和Ank5′-2，通过剿式PCR技术扩增3′末端序列和5′末端序列。用DNAMAN6.0软件对CS-Ankyrin cDNA 3′末端序列、验证扩增cDNA部分序列以及5′末端序列进行拼接。PCR扩增体系为：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，LATaq Mix12.5 μL，补ddH2O至总体积为25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，退火（Tm）30 s，72 ℃ ts，35个循环；72 ℃ 10 min。

将所获得的PCR产物经电泳、染色和凝胶成像，切割回收纯化目的片段，连接于pMD18-T Simple Vector（购自TAKARA公司），然后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆进行PCR检测，挑取阳性菌落送华大基因公司测序。基因克隆的引物序列、退火温度、延伸时间见表1。

1.2.3 RT-qPCR分析 参照Pfaffl[19]和孙美莲等[20]的方法对CS-Ankyrin基因在“1005”、黄旦和福云7号3个品种（品系）的芽、二叶、四叶3个不同发育阶段叶片的表达进行实时荧光定量PCR，在基因的保守序列区域设计引物Ank-QF和Ank-QR。按照步骤1.2.1的方法提取3个品系不同发育阶段叶片的总RNA，参照SYBR Ex-ScriptTM试剂盒反转录合成cDNA第一链，qPCR反应体系为：上下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ10 μL，ddH2O补足至20 μL。加好反应程序为95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s， 40个循环，然后然后进行55～94 ℃的熔接曲线分析。以孙美莲等[20]筛选的GAPDH基因为内参基因，反应在LightCycler480Ⅱreal-time quantity PCR仪（Roche公司）进行。RT-qPCR引物见表1。

1.2.4 EGCG含量测定 利用高效液相色谱法（HPLC）测定“1005”、黄旦、福云7号3个品种（品系）嫩芽、二叶、四叶各个样品的EGCG含量（GB/T 8313-2008）[21]。

1.2.5 亚细胞定位分析 根据已知的CS-Ankyrin的ORF序列设计含NcoⅠ和SpeⅠ酶切位点的上下游引物AnkGFP-F和AnkGFP-R（表1），以芽cDNA为模板，扩增添加酶切位点的目的片段，并回收纯化。用限制性内切酶NcoⅠ和SpeⅠ酶切pCAMBIA 1302载体以及纯化的目的片段，酶切体系为：目的片段或者pCAMBIA 1302载体16 μL（总量不超过1 μg），NcoⅠ和SpeⅠ酶各1 μL，10xFast digest green buffer 2 μL，总体积20 uL，37 ℃酶切10 min，冰上终止反应，分别凝胶电泳回收纯化目的片段与pCAMBIA 1302载体，然后进行连接构建瞬时表达载体pCAMBIA1302-GFP-Ank，连接体系为：pCAMBIA 1302载体0.5 μL，目的片段4.5 μL，SolutionⅠ5.0 μL，总体积10 μL。载体构建完成后，提取重组质粒并侵染农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染转化洋葱表皮细胞，将转化过的洋葱表皮菌液稍稍虑干，平铺于MS固体培养基，置于25 ℃培养箱共培养3 d，最后在共聚焦显微镜下（尼康）观察并拍照。亚细胞定位引物见表1。

2 结果与分析

2.1 茶树CS-Ankyrin基因全长序列克隆

在本实验室课题组已有的茶树转录组数据的基础上，利用上下游引物Ank-F和Ank-R进行CS-Ankyrin基因部分序列的扩增，测序结果表明总长度为1 255 bp（包括上下游引物序列）。通过NCBI在线blast比对分析，得到1 255 bp序列与Genbank登录的多种植物的Ankyrin基因高度一致，因此可认定为茶树Ankyrin基因的部分序列。通过3′-RACE和5′-RACE两轮剿式PCR分别扩增出CS-Ankyrin基因的3′端序列和5′序列。通过DNAMAN6.0软件进行拼接，最后得到2 034 bp的全长序列，通过DNAMAN6.0和ORF Finder对CS-Ankyrin全长序列进行分析，开放阅读框（ORF）为1 626 bp，起始于第354 bp，以ATG为起始密码子，终止于第1 979 bp，以TAA为终止密码子，编码541个氨基酸，5′-UTR和3′-UTR长度分别为353 bp和55 bp（图1）。将克隆得到的转录本核苷酸全长序列进行在线blast比对分析，与Vitis vinifera（葡萄）、 Ricinus communis（蓖麻）、Theobroma cacao（可可）和Populus trichocarpa（杨树）的Ankyrin序列的一致性分别为78%、78%、77%和77%，结果说明所得序列为茶树Ankyrin基因，命名为CS-Ankyrin，GenBank登录号为KM236566。

2.2 茶树CS-Ankyrin基因生物信息学分析

用Protparam预测分析CS-Ankyrin基因编码蛋白的理化性质，相对分子量为58 785.9 u，等电点为9.34。该蛋白质由20种氨基酸组成，丙氨酸（Ala）等8种疏水氨基酸的含量为45.6%，甘氨酸（Gly）等12种亲水氨基酸的含量为54.4%。各种氨基酸中，其中含量最高的为丙氨酸（Ala），总含量为12.0%，其次是缬氨酸（Val）9.5%，含量最少的为色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys），都仅含有0.6%。带正电残基总数和带负电残基总数分别为62和51，平均亲水性为0.005，脂肪指数为100.98，推测该蛋白质为疏水蛋白，但疏水性差。Tmpred在线软件预测CS-Ankyrin蛋白存在4个跨膜区段，为跨膜蛋白。PSORT在线软件对CS-Ankyrin进行亚细胞定位预测分析，可以预测CS-Ankyrin蛋白最可能定位在质膜上，可能性为0.6。ScanProsite对CS-Ankyrin蛋白进行结构域分析结果显示CS-Ankyrin锚蛋白重复序列由5个ANK单元组成（图2），氨基酸序列分布分别为98～130、132～164、166～198、200～222、234～255。

为了比较CS-Ankyrin基因和其他物种Ankyrin基因的亲缘关系，分别与葡萄、蓖麻和可可等多个物种的Ankyrin基因的全长氨基酸序列进行比对分析，结果见图3。从构建的进化树可以看出，茄科番茄（Solanum lycopersicum）、胡麻科芝麻（Sesamum indicum）、 茄科马铃薯（Solanum tuberosum）、茄科拟茸毛烟草（Nicotiana tomentosiformis）、茄科烟草（Nicotiana sylvestris）聚集在同一支上，与芝麻的亲缘关系最为接近，通过NCBI在线软件BLASTp表明，CS-Ankyrin与以上几种植物在氨基酸水平上的一致性分别为75%、79%、75%、76%和76%。

2.3 CS-Ankyrin在不同叶位的表达分析和EGCG含量测定

采用2-△△CT法对CS-Ankyrin基因的qPCR扩增结果进行数据分析[20]，进而确定基因的相对表达量，结果见图4。CS-Ankyrin基因在“1005”新品系，及普通茶树黄旦和福云7号的表达趋势一致，在芽头相对表达水平最高，二叶次之，四叶表达水平最低。利用高效液相色谱法（HPLC）测定了不同样品的EGCG含量，结果见图5。在3个品种（品系）中，EGCG含量变化趋势一样，芽头的EGCG含量最高，二叶次之，四叶的EGCG含量最少。通过比较发现，3个品种（品系）中不同发育阶段叶片的EGCG含量变化趋势与CS-Ankyrin基因表达趋势一致，同时同一品种（品系）不同发育阶段叶片，CS-Ankyrin基因相对表达量越高，EGCG含量越高。

“1005”新品系的EGCG含量明显超过了2个亲本，表现出了一定的杂种优势，特别是芽和二叶；此外，与亲本相比，“1005”品系CS-Ankyrin基因的相对表达量比2个亲本高，本实验结果与Yao等[22]和Stupar等[23]杂种优势的相关理论一致。

2.4 CS-Ankyrin的亚细胞定位

为了探究CS-Ankyrin蛋白在植物亚细胞结构中的分布情况，将构建的CS-Ankyrin基因瞬时表达载体转化到洋葱内表皮细胞进行共培养，通过共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白信号，结果见图6。从图6可以看出，导入pCAMBIA1302-GFP空载体的洋葱细胞，在其细胞膜、细胞质和细胞核均发出绿色荧光信号（图6-A～C），而转入构建好的载体pCAMBIA1302-GFP-Ank的洋葱细胞只有在细胞膜上发出绿色荧光（图6-D～F），说明GFP-Ank融合蛋白移动至细胞膜起作用。

3 讨论与结论

锚蛋白重复系列是生物体普遍存在的一种蛋白质基序，锚蛋白重复序列一般含有2～25个不等的ANK单元，串联形成大的ANK结构域，典型的ANK单元一般由33个氨基酸组成。锚蛋白重复序列主要是介导蛋白质之间的相互作用，ANK单元数量和附近相关序列的差异，使得含有锚蛋白序列的蛋白质功能复杂多样。生物信息学分析表明，CS-Ankyrin蛋白与其亲缘关系接近的几种植物的Ankyrin蛋白氨基酸一致性非常高（75%以上），与其亲缘关系最为接近的芝麻一致性达到79%，说明本研究克隆得到的基因为Ankyrin基因。此外，通过蛋白结构域分析表明，CS-Ankyrin锚蛋白重复序列总共有5个ANK单元组成，前3个单元均由33个氨基酸组成，具有典型ANK结构单元，进一步确定CS-Ankyrin基因为Ankyrin基因。后面2个单元为23个氨基酸和22个氨基酸组成，并不是属于典型的ANK单元，但也有研究表明在其他基因中也见过这种现象，如INK4蛋白[24]和Nbar蛋白[25]。

一般在ANK蛋白的C-端是具有调控功能的结构域，而在N-端是膜结合位点。ANK蛋白的功能特点主要是由其结构特点和细胞定位所决定的。生物信息学表明CS-Ankyrin蛋白为疏水蛋白，且为存在4个跨膜区域的跨膜蛋白，但疏水性不强，亚细胞定位实验表明，该蛋白主要定位在细胞膜上起作用，与PSORT在线软件预测基本一致，这些就为CS-Ankyrin蛋白发挥作用与功能提供了条件和依据。比较3个品种（品系）中CS-Ankyrin基因的相对表达趋势和EGCG含量变化，在同一品种（品系）中，CS-Ankyrin基因表达和EGCG含量变化趋势呈正相关，叶片发育程度越高，CS-Ankyrin基因相对表达量越低，EGCG含量也越少。因此，初步判断CS-Ankyrin蛋白为细胞膜上的跨膜蛋白，参与胞内物质的储存和跨膜运输，与拟南芥ACBP2[26]蛋白功能类似，但具体的机制有待进一步的探究。

子代“1005”品系的EGCG含量变化以及CS-Ankyrin基因表达特性均表现出了一定程度的杂种优势，但单纯的表达谱只能从基因表达量进行探究。目前在烟草、棉花、玉米等许多植物都发现了杂种优势，并得到了很好的运用与推广，但是杂种优势的分子机理较为复杂，仍未完全明确，涉及核质互作、基因的甲基化、小RNA表达调控和基因表达差异等各方面。此外，从基因表达调控角度分析，生物体杂种优势不仅涉及基因的差异表达，还包括小基因组甚至多基因的协同调控；杂种子代任何一个单基因的表达调控可能都有它自身的复杂遗传基础，包括剂量补偿效应和表观遗传修饰，甚至与其他组分的相互协作都可能存在一定相关性[27]。

Ankyrin repeat锚蛋白在植物中是一个非常大的蛋白家族，在植物的生长发育、环境胁迫、信号传导、物质运输、疾病防疫等过程中起作用[28-31]。本研究仅根据CS-Ankyrin基因的表达特征、亚细胞定位及EGCG含量变化来推测CS-Ankyrin基因在EGCG合成中的可能作用，还需要进一步的实验研究来阐述CS-Ankyrin的确切功能，比如在烟草通过RNAi抑制CS-Ankyrin表达，或者过量表达CS-Ankyrin基因等实验来进一步探究其功能。

参考文献

[1] Annaba F， kumar P， Dudeja A k， et al. Green tea catechin EGCG inhibits ileal apical sodium bile acid transporter ASBT[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2010， 298（3）： 467-473.

[2] Ortsater H， Grankvist H， Wolfram S， et al. Diet supplementation with green tea extract epigallocatechin gallate prevents progression to glucose intolerance indb/db mice[J]. Nutrition & Metabolism， 2012， 9： 11.

[3] Park S Y， Lee Y K， Kim Y M， et al. Control of AMP-activated protein kinase， Akt， and mTOR in EGCG-treated HT-29 colon cancer cells[J]. Food Sci. Biotechnol， 2013， 22（1）： 147-151.

[4] Luo X B， Rongfa Guan， Chen X Q， et al. Optimization on condition of epigallocatechin-3-gallate（EGCG）nanoliposomes by response surface methodology and cellular uptake studiesin Caco-2 cells[J]. Nanoscale Research Letters， 2014， 9： 291.

[5] Zang P， Qu W L， Yu Y B， et al. Study on antioxidation with EGCG in the food system[J]. Science and Technology of Food Industry， 2011， 11： 361-363.

[6] George J， Nigam N， Shukla Y. Tea： age-old beverage as an effective cancer chemopreventive agent[J]. Oncology Reviews，2008， 1（4）： 243-252.

[7] Narotzki B， Levy Y， Aizenbud D， et al. Green tea and its major pPolyphenol EGCG increase the activity of oral peroxidases[J]. Advances in experimental medicine and biology，2013， 756： 99-104.

[8] Huo C， Yang H， Cui Q C， et al. Proteasome inhibition in human breast cancer cells with high catechol-O-methyltransferase activity by green tea polyphenol EGCG analogs[J]. Bioorg Med Chem， 2010， 18（3）： 1 252-1 258.

[9] Anderson R A， Polansky M M. Tea enhances insulin activity[J]. J Agric Food Chem， 2002， 50（24）： 7 182-7 186.

[10] 乔小燕， 马春雷， 陈 亮. 植物类黄酮生物合成途径及重要基因的调控[J]. 天然产物研究与开发， 2009， 21（2）： 354-360.

[11] Punyasiri P A， Abeysinghe I S， Kumar V， et al. Flavonoid biosynthesis in the tea plant properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathways[J]. Arch Biochem Biophys， 2004， 431（1）： 22-30.

[12] Wei K， Wang L， Zhou J， et al. Catechin contents in tea（Camellia sinensis）as affected by cultivar and environmentand their relation to chlorophyll contents[J]. Food Chemistry， 2011， 125（1）： 44-48.

[13] 陆建良， 林 晨， 骆颖颖，等. 茶树重要功能基因克隆研究进展[J]. 茶叶科学， 2007， 27（2）： 95-103.

[14] Xie D Y， Sharma S B， Paiva N L， et al. Role of anthocyanidin reductase，encoded by BANYULSin plant flavonoid biosynthesis[J]. Science， 2003， 299（5 605）： 396-399.

[15] 胡晓婧， 许玉娇，高丽萍， 等. 茶树黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）的克隆及功能分析[J]. 农业生物技术学报， 2014，22（3）：309-316.

[16] Mosavi L K， Cammett T J， Desrosiers D C， et al. The ankyrin repeat as molecular architecture for protein reconition[J]. Protein Sci， 2004， 13： 1 435-1 448.

[17] Li J， Mahajan A， Tsai M D， et al. Ankyrin repeat： a unique motif mediating protein-protein interactions[J]. Biochemistry，2006， 45（51）： 15 168-15 178.

[18] 吴利民， 李东屏. 植物锚蛋白研究进展[J]. 生物技术通报，2005（6）： 7-11.

[19] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res，2001， 29（9）： e45.

[20] 孙美莲， 王云生，杨冬青， 等. 茶树实时荧光定量 PCR分析中内参基因的选择[J]. 植物学报， 2010， 45（5）： 579-587.

[21] 中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院. GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S]. 北京： 中国标准出版社.

[22] Yao Y Y， Ni Z F， Zhang Y H， et al. Identification of differentially expressed genes in leaf and root between wheat hybrid and its parental inbreds using PCR-based cDNA subtraction[J]. Plant Mol Biol， 2005， 58（3）： 367-384.

[23] Stupar R M， Springer N M. Cis-transcriptional variation in maize inbred lines B73 and Mo17 leads to additive expression patterns in the F1 hybrid[J]. Genetics， 2006， 173（4）： 2 199-2 210.

[24] Rechsteiner M， Rogers S W. PEST sequences and regulation by proteolysis[J]. Trends Biochem Sci， 1996， 21（7）： 267-271.

[25] 吴 田，谢从华. 烟草富含锚蛋白重复结构域基因Nbar的克隆及序列分析[J]. 西南林学院学报， 2010， 30（1）： 38-41.

[26] Chye M L， Li H Y， Yung M H. Single amino acid substitutions at the acyl-CoA- binding domain interrupt 14 palmitoyl-CoA binding of ACBP2， an Arabidopsis acyl-CoA-binding protein with ankyrin repeats[J]. Plant Molecular Biology， 2000， 44（6）： 711-721.

[27] Krieger U， Lippman Z B， Zamir D. The flowering gene SINGLE FLOWER TRUSS drives heterosis for yield in tomato[J]. Nat Genet， 2010， 5： 459-463.

[28] Ha C M， Jun J H， Nam H G， et al. BLADE-ON-PRTIOLER1 encodes a BTB/POZ domain protein required for leaf morphogenesis in arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Physiol， 2004， 45（10）： 1 361-1 370.

[29] 杜海宁， 胡红雨.锚蛋白重复序列介导的蛋白质与蛋白质相互作用[J]. 生物化学与生物物理进展， 2002， 29（1）： 6-9.

[30] Luo H， Song F， Goodman R M， et al. Up-regulation of OsBIHD1， a rice gene encoding BELL homeodomain transcriptionalfactor， in disease resistance response[J]. Plant Biology， 2005， 7： 459-468.

[31] 张 璇， 库里满·恰里甫， 武玉翠， 等. 丹参锚蛋白重复序列家族基因的克隆和表达分析[J]. 陕西师范大学学报， 2013， 41（4）： 63-66.