酶解法提取大高良姜多糖工艺优化及抗氧化活性分析

刘源 张孝琴 王译伟 杨刚

摘要：【目的】優化酶解法提取大高良姜多糖工艺，并分析其抗氧化活性，为大高良姜多糖的有效利用提供技术支持。【方法】以多糖提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman（PB）试验法对影响大高良姜多糖提取率的5个因素进行筛选；根据PB试验结果，选取3个主要影响因素，通过Box-Behnken响应面试验对提取工艺进行优化，确定最佳工艺条件；同时测定大高良姜多糖对DPPH和ABTS自由基的清除率。【结果】酶解法提取大高良姜多糖最佳工艺条件：料液比1∶24、pH 6.0、酶解时间50.5 min、酶解温度44 ℃、酶用量2%，在此条件下多糖提取率为13.53%。与传统热水浸提法比较，酶解法提取时间缩短72.0%，提取率提高24.1%。大高良姜多糖对DPPH和ABTS自由基均有较强的清除能力，其半数有效质量浓度（IC50）分别为2.21 mg/mL和2.15 g/mL。【结论】响应面试验模型能较好优化酶解法提取大高良姜多糖工艺，优化后的工艺具有操作简单、省时高效、无毒环保等优点，提取得到的多糖有较强的抗氧化能力，可为后续开发利用大高良姜提供技术支持。

关键词： 大高良姜多糖；酶解法；Plackett-Burman试验法；Box-Behnken响应面法；抗氧化活性

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1376-07

Abstract：【Objective】The extraction process of polysaccharide from Alpinia galanga Willd. by enzymolysis method was optimized， in order to provide technical support for effectively using polysaccharide from A. galanga. 【Method】With extraction rate of polysaccharides as index， the five factors affecting extraction rate of polysaccharides from A. galanga were screened by Plackett-Burman method on the basis of single factor experiment. According to the results of Plackett-Burman test， three main influencing factors were selected. Then the extraction process was optimized by by using the Box-Behnken response surface method， so as to determine optimum process conditions. Meanwhile， the scavenging rate of polysaccharide from A. galangal to DPPH free radical and ABTS free radical was determined. 【Result】The optimum process conditions of extracting polysaccharides were as follows： solid-liquid ratio of 1∶24， pH of 6.0， enzymolysis time of 50.5 min， enzymolysis temperature of 44 ℃， enzyme dosage of 2%. Under the above optimum conditions， the extraction rate of polysaccharide was 13.53%. Compared with traditional hot-water extraction method， the enzymolysis method took shorter time， so the extraction time was shortened by 72.0%， but the extraction rate was increased by 24.1%. Furthermore， polysaccharide from A. galanga had strong ability to scavenge DPPH and ABTS free radicals， and the half effective mass concentration（IC50） was 2.21 mg/mL and 2.15 g/mL， respectively. 【Conclusion】The response surface experimental model can optimize extraction process of polysaccharide from A. galangal， the enzymatic method can improve the extraction rate of polysaccharides. The extraction process has the advantages of simple operation， time saving， high efficiency， no toxicity and environmental protection， etc.， and extracted polysaccharide has more stronger antioxidant activity， therefore this process can provide scientific basis for development of A. galangal in future.

Key words： Alpinia galangal Willd. polysaccharide； enzymolysis method； Plackett-Burman test； Box-Behnken response surface method； antioxidant activity

0 引言

【研究意义】大高良姜又名大良姜、良姜、山姜，为姜科山姜属植物大高良姜[Alpinia galanga（L.） Willd.]的根茎，是《中国药典》收录的药用植物，果实入药称为红豆蔻。根茎粗壮、圆形、有节，棕红色并略有辛辣味，能温胃、散寒、行气止痛（赵志礼等，2001），常用作调经剂、催欲剂、堕胎药、驱风剂、退热剂和抗炎药等，也可用于治疗支气管炎、心脏疾病、慢性肠炎、肾结石、糖尿病及风湿病等疾病（Kaushik et al.，2011）。已有研究发现，姜科植物多糖具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等作用（李世杰等，2013）。因此，研究大高良姜多糖的提取工艺及抗氧化活性，对其药用开发与利用具有重要意义。【前人研究进展】目前对大高良姜的研究主要集中于黄酮和色素的提取工艺研究，如黄俊生等（2010）优化热水浸提大高良姜色素的工艺条件；牛付阁（2011）研究热水提取大高良姜黄酮工艺；彭晶等（2013）利用酶法提取大高良姜黄酮，并对其工艺进行优化。近年来，有关姜科植物的多糖提取研究较少，樊亚鸣等（2007）对微波—水溶液提取春砂仁多糖的工艺进行优化，结果表明，在液固比10∶1、微波功率600 W、提取温度80 ℃的条件下提取20 min，多糖产率为11.33%；郑义等（2014）利用热水浸提高良姜多糖，在最佳工艺条件（液料比43∶1、浸提温度95 ℃、浸提时间3 h）下获得多糖产率11.81%。而有关大高良姜有效成分的抗氧化活性研究報道甚少，至今仅有王蓓蓓等（2011）比较研究高良姜与大高良姜总黄酮抗氧化活性，结果发现大高良姜中总黄酮的抗氧化活性强于高良姜。【本研究切入点】酶解法提取是通过纤维素酶破坏提取植物细胞，使内部物质从细胞中释放出来，降低提取难度，具有高效、无毒等优点，已广泛应用于植物多糖的提取（汪财生等，2010；周立等，2014），但目前尚无利用此法提取大高良姜多糖的研究报道。【拟解决的关键问题】利用Design-Expert 8.0.6软件，将Plackett-Burman（PB）试验和Box-Behnken响应面试验相结合，优化酶解法提取大高良姜多糖的工艺，并研究其抗氧化活性，旨在为大高良姜多糖的有效利用提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

大高良姜采自四川省泸州市龙马潭区特兴镇魏园村黄金山生态园，除去茎叶杂质，经清水冲洗后切片晒干，粉碎过60目筛备用。纤维素酶（酶活单位≥50 U/mg，最适温度30～60 ℃，最适pH 4.0～6.5）购自江苏锐阳生物科技有限公司，DPPH购自美国Sigma公司，ABTS购自碧云天生物技术有限公司，维生素C（Vc）购自东北制药集团有限公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、无水乙醇均为国产分析纯。主要仪器设备：RE52CS-1旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、MCR-3S微波炉（西安予辉仪器有限公司）、SP-1901型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、FW80-1粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、HH-2数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 大高良姜多糖提取 准确称取大高良姜粉→添加一定量的酶→加入50%乙醇溶解→调节pH→控制酶解温度→水浴锅酶解提取→90 ℃灭酶30 min→抽滤→定容→计算提取率。

1. 2. 2 多糖提取率测定 以葡萄糖质量浓度为x轴、490 nm处测定的吸光值为y轴，拟合回归曲线，得回归方程：y=156.3x+2.858（R2=0.9992），绘制得标准工作曲线。

多糖提取率（%）=提取得到的多糖质量/原料总质量×100

1. 2. 3 单因素试验 采用控制变量法，依次改变料液比、酶解时间、酶解温度、pH、酶用量5个因素，结合标准工作曲线，以多糖提取率为评价指标进行分析。

1. 2. 4 PB试验设计 在单因素试验的基础上，对上述5个因素进行筛选试验，试验因素水平如表1所示，再根据试验结果确定影响显著的因素进行响应面试验。

1. 2. 5 Box-Behnken响应面试验设计 在单因素试验和PB筛选试验的基础上，对所确定的因素进行响应面试验，确定最佳多糖提取工艺条件，试验因素水平如表2所示。

1. 2. 6 对比试验 采用响应面试验优化工艺进行酶解法提取试验，再结合传统热水浸提法的结果，比较两种方法对大高良姜多糖提取率的优劣性。

1. 2. 7 多糖抗氧化活性测定

1. 2. 7. 1 DPPH自由基清除率测定 将大高良姜多糖配成不同质量浓度的溶液，分别取2.0 mL置于容量瓶中，再分别加入2.0 mL 1 mmol/L DPPH溶液，混匀后于25 ℃避光反应30 min，在517 nm处测定吸光值A1。同时取2.0 mL不同质量浓度多糖溶液，分别加入2.0 mL 95%乙醇后，测定吸光值A2。最后取2.0 mL蒸馏水加入2.0 mL 1 mmol/L DPPH溶液测定吸光值A0，根据公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）=（1-■）×100

1. 2. 7. 2 ABTS自由基清除率测定 先配制ABTS工作液，再分别取0.1 mL稀释后的不同质量浓度大高良姜多糖提取液与3.9 mL ABTS工作液混合成样品液，室温避光反应6 min后测定样品液在734 nm处的吸光值A；以0.1 mL蒸馏水与3.9 mL ABTS工作液混合进行空白试验，测定吸光值A0，根据公式计算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率（%）=■×100

1. 3 统计分析

采用SPSS 19.0进行单因素方差分析；采用Design-Expert 8.0.6进行响应面分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 料液比对大高良姜多糖提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h、酶用量3%，考察不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40）对大高良姜多糖提取率的影响，结果见图1。开始时随着料液比的降低，大高良姜多糖提取率逐渐增大，当料液比小于1∶25时，多糖提取率反而减少；其中料液比为1∶25时提取率最高（11.68%），与料液比1∶30和1∶35的提取率无显著差异（P>0.05，下同）。因此，選择料液比1∶20和1∶30进行PB试验。

2. 1. 2 酶解时间对大高良姜多糖提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解温度50 ℃、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）对大高良姜多糖提取率的影响，结果见图2。多糖提取率随酶解时间的延长逐渐增大，酶解时间为1.0 h时达最大值，且多糖提取率与0.5、2.0、2.5 h的多糖提取率有显著差异（P<0.05，下同）；酶解时间过长（超过1.0 h），多糖提取率逐渐下降。最终选择0.5和1.5 h作为PB试验的酶解时间。

2. 1. 3 酶解温度对大高良姜多糖提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解时间2.0 h、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同酶解温度（35、40、45、50和55 ℃）对大高良姜多糖提取率的影响，结果见图3。大高良姜多糖提取率随着酶解温度的升高逐渐增加，超过45 ℃后逐渐下降；酶解温度在40～55 ℃范围内多糖提取率无显著性差异，最终选择40和50 ℃作为PB试验的酶解温度。

2. 1. 4 pH对大高良姜多糖提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，固定酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h、酶用量3%、料液比1∶30，考察不同pH（4.5、5.0、5.5、6.0和6.5）对大高良姜多糖提取率的影响，结果见图4。根据图中多糖提取率随着pH变化的规律，发现pH为6.0时多糖提取率最高，之后多糖提取率减少，pH在5.0～6.5范围内多糖提取率无显著性差异，因此选择pH 5.5和6.5进行PB试验优化。

2. 1. 5 酶用量对大高良姜多糖提取率的影响 采用1.2.1的提取方法，固定pH 5.5、酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h、料液比1∶30，考察不同酶用量（1%、2%、3%、4%和5%）对大高良姜多糖提取率的影响，结果见图5。根据图中多糖提取率随酶用量变化的规律，发现在酶用量2%～5%范围内，多糖提取率的变化不显著，但在酶用量2%～3%时出现小幅高峰值，因此选择酶用量为1%和3%进行PB试验。

2. 2 响应面优化大高良姜多糖提取工艺

2. 2. 1 PB试验筛选显著影响大高良姜多糖提取率的因素 综合单因素试验结果，运用Design-Expert 8.0.6设计12次PB试验，进行料液比（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）、pH（D）、酶用量（E）5个因素对多糖提取率的显著性考察，其试验结果见表2。表3为上述5个因素对多糖提取率的回归方程系数及显著性检验结果，由表3可知，酶解温度和酶解时间对大高良姜多糖提取率影响极显著（P<0.01，下同），料液比影响显著。结合考虑实际生产的需求，确定pH为6.0、酶用量为2%，选择料液比、酶解温度和酶解时间为响应面试验考察因素。

2. 2. 2 响应面试验结果 根据Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken响应面试验设计原理，综合单因素试验和PB试验结果，确定料液比、酶解时间、酶解温度为主要因素，设计3因素3水平响应面分析试验，其方案及结果如表5所示。采用Design-Expert 8.0.6对表5数据进行多元回归拟合分析，得到模型的拟合曲线方程为：Y=13.35-0.21A-0.36B-0.38C+0.70AB+0.47AC+

0.022BC-1.15A2-0.83B2-1.15C2。

对模型进行回归系数和方差分析的显著性检验，结果见表6。由表6可知，该模型的Prob>F，为0.0001（小于0.01），表明该模型的回归方程具有显著性。3个因素对大高良姜多糖提取率影响排序为：C（酶解温度）>B（酶解时间）>A（料液比），其中，作用显著的是B和AC，极显著的是C、AB、A2、B2和C2。

2. 2. 3 响应面分析因素之间的交互作用 根据拟合回归方程，固定料液比、酶解时间和酶解温度中的任意两个因素为零水平时，作出两个交互项的响应面图，以考察其对大高良姜多糖提取率的影响，见图6～图8。响应曲面坡度较平滑，说明响应值受各变量变化的影响较小；响应曲面坡度较陡峭，则说明响应值受变量交互作用较明显。从图6～图8可以看出，料液比与酶解时间交互作用的坡度最陡峭，说明影响最显著，而酶解温度与酶解时间的响应面坡度先升高后逐渐趋于平缓，说明影响不显著。这与响应面方差分析结果相一致。

2. 2. 4 最佳提取条件的确定和验证 利用Design-

Expert 8.0.6得到最佳提取工艺为：料液比1∶23.85、酶解时间0.84 h、酶解温度43.93 ℃，在此条件下大高良姜多糖提取率的预测值为13.4718%。综合考虑多糖提取率和试验可操作性等因素，修正最优工艺条件为：料液比1∶24、pH 6.0、酶解时间50.5 min、酶解温度44 ℃，酶用量2%，对其进行验证，得到实际测定值为13.53%，相对误差0.43%。表明本研究建立的模型推测得到的最佳工艺参数对实际预测较可靠，有一定指导意义。

2. 3 传统热水浸提法和酶解法比较结果

改变1.2.1提取工艺，采用传统热水浸提法进行试验，确定料液比1∶24、浸提时间3 h、浸提温度95 ℃，多糖提取率为10.90%。与传统热水浸提法相比较，酶解法的提取时间缩短72.0%，提取率提高24.1%，酶解法提取大高良姜多糖的效果更佳。

2. 4 大高良姜多糖抗氧化活性分析结果

2. 4. 1 大高良姜多糖对DPPH自由基的清除效果 大高良姜多糖对DPPH自由基的清除作用结果见图9，以Vc为参照，DPPH自由基清除能力随大高良姜多糖质量浓度的增大而增强，清除率最大值为85.74%，清除能力略低于Vc。大高良姜多糖的半数有效质量浓度（IC50）为2.21 mg/mL。

2. 4. 2 大高良姜多糖对ABTS自由基的清除效果 大高良姜多糖對ABTS自由基的清除作用结果见图10，多糖质量浓度在1.00～5.00 g/mL范围内，其对ABTS自由基的清除率高于Vc，大高良姜多糖的IC50为2.15 g/mL。

3 讨论

目前，对大高良姜同属姜科类植物的多糖提取多采用传统工艺，如王晓梅等（2011）采用水提醇沉法提取生姜多糖，平均提取率为7.58%；郑义等（2014）采用热水浸提高良姜多糖，得到提取率11.81%。本研究利用纤维素酶水溶液破坏大高良姜的细胞壁，极大改善细胞壁的通透性，最大程度地溶出多糖化合物；在单因素试验的基础上，将PB试验和响应面试验相结合进行拟合，优化得到酶解法提取大高良姜多糖的提取工艺为：料液比1∶24、pH 6.0、酶解时间50.5 min、酶解温度44 ℃、酶用量2%，在此条件下多糖提取率为13.53%，明显高于与其他姜科类植物的多糖提取率，如樊亚鸣等（2007）测定的春砂仁多糖提取率11.33%，郑义等（2013）测定的益智仁多糖提取率7.71%。与传统热水浸提法比较，采用酶解法提取大高良姜多糖所需时间缩短72.0%、能源消耗减少53.7%、提取率提高24.1%，说明采用响应面试验优化的酶解法提取大高良姜多糖更有效。

姜科类植物多糖均具有较强的抗氧化活性，郑义等（2013）研究益智仁多糖抗氧化活性的结果表明，益智仁多糖质量浓度为2 g/L时，其对DPPH的清除率达90.06%；郑义等（2014）对高良姜多糖的抗氧化活性进行研究，发现高良姜多糖质量浓度为5 g/L时，其对DPPH的清除率达98.36%。本研究对大高良姜多糖的抗氧化活性进行分析，结果表明，大高良姜多糖对DPPH和ABTS自由基均有一定的清除能力；随着大高良姜多糖质量浓度的不断增大，多糖的抗氧化能力也不断增强，其IC50分别为2.21 mg/mL和2.15 g/mL。

目前对于大高良姜多糖的研究尚处于初级阶段，后续应对其结构鉴定和药理性质进行相关研究，以及对比分析大高良姜整株的不同部位多糖含量。本研究优化工艺可为后续研究提供技术支持。

4 结论

采用响应面试验模型能较好优化酶解法提取大高良姜多糖工艺，优化后的工艺具有操作简单、省时高效、无毒环保等优点，提取得到的多糖有较强的抗氧化能力。

参考文献：

樊亚鸣，罗月霞，陈永亨，罗亚红. 2007. 春砂仁多糖的微波—水溶液提取及纯化工艺研究[J]. 农业工程学报，23（7）：218-221.

Fan Y M，Luo Y X，Chen Y H，Luo Y H. 2007. Optimized technology for microwave-aqua extraction and purification of Amonum villosum L. polysaccharides[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，23（7）：218-221.

黄俊生，曹迁永，曹少骏. 2010. 大高良姜色素的提取工艺及稳定性研究[J]. 中国调味品，35（11）：99-104.

Huang J S，Cao Q Y，Cao S J. 2010. Study on extraction technology and stability of Alpinia galanga（L.） Willd. pigment[J]. China Condiment，35（11）：99-104.

李世杰，张丹雁，严娅娟，曹曼. 2013. 响应面法优化阳春砂多糖的超声辅助提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，19（22）：47-51.

Li S J，Zhang D Y，Yan Y J，Cao M. 2013. Optimization of ultrasound-assisted extraction technology of polysaccharides from Amomum villosum by response surface methodology[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，19（22）：47-51.

牛付阁. 2011. 大高良姜黄酮的提取、分离纯化及抗氧化作用研究[D]. 西安：陕西师范大学.

Niu F G. 2011. Study on extraction，isolatio，purification and activity of flavonoids from Alpinia galangal Willd[D]. Xian：Shaanxi Normal University.

彭晶，杨颖，牛付阁，李清宇，贾琳斐，段玉峰，郭行. 2013. 响应曲面法优化大高良姜黄酮酶法提取工艺[J]. 食品科学，34（14）：169-172.

Peng J，Yang Y，Niu F G，Li Q Y，Jia L F，Duan Y F，Guo X. 2013. Optimization of enzymatic extraction of flavonoids from galangal rhizomes（Alpinia galanga）[J]. Food Science，34（14）：169-172.

王蓓蓓，牛付阁，段玉峰. 2011. 高良姜与大高良姜总黄酮抗氧化活性比较研究[J]. 食品科学，32（7）：117-120.

Wang B B，Niu F G，Duan Y F. 2011. Comparison of antioxidant activity of total flavonoids from Alpinia officinarum Hance and Alpinia galangal Willd[J]. Food Science，32（7）：117-120.

汪财生，孙安吉，王忠华，游广宇. 2010. 紫山药多糖酶法提取工艺优化研究[J]. 食品工业科技，31（2）：266-269.

Wang C S，Sun A J，Wang Z H，You G Y. 2010. Study on optimization of enzymatic extraction polysaccharide from purple yam[J]. Science and Technology of Food Industry，31（2）：266-269.

王晓梅，张忠山，郑卫红，赵明星. 2011. 生姜多糖的提取纯化工艺及鉴定[J]. 中国调味品，36（5）：44-46.

Wang X M，Zhang Z S，Zheng W H，Zhao M X. 2011. Extration，purification and identification of polysaccharide from ginger[J]. China Condiment，36（5）：44-46.

赵志礼，王峥涛，董辉，徐珞珊，林秀富. 2001. 山姜属药用植物及生药学研究进展[J]. 中草药，32（2）：171-173.

Zhao Z L，Wang Z T，Dong H，Xu L S，Lin X F. 2001. Advances in studies on medicinal plants and pharmacognosy of Aplinia Roxb.[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，32（2）：171-173.

鄭义，李勇，王卫东，施秋仪. 2013. Box-Behnken设计优化益智仁多糖的提取及其抗氧化活性[J]. 食品与发酵工业，39（8）：245-249.

Zheng Y，Li Y，Wang W D，Shi Q Y. 2013. Optimization of extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Alpinia oxyphylla by Box-Behnken design[J]. Food and Fermentation Industries，39（8）：245-249.

郑义，王卫东，李勇，朱园园，郭静. 2014. 高良姜多糖提取工艺优化及其抗氧化活性[J]. 食品科学，35（2）：126-131.

Zheng Y，Wang W D，Li Y，Zhu Y Y，Guo J. 2014. Optimization of extraction process and antioxidant activities of polysaccharides from Alpinia officinarum Hance[J]. Food Science，35（2）：126-131.

周立，刘裕红，贾俊. 2014. 复合酶法提取金银花多糖及其抗氧化性[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），45（5）：646-650.

Zhou L，Liu Y H，Jia J. 2014. Extraction process of polysaccharide from Lonicera japonica with compound enzyme treatment and its antioxidant activity[J]. Journal of Shandong Agricultural University（Natural Science Edition），45（5）：646-650.

Kaushik D，Yadav J，Kaushik P，Sacher D，Rani R. 2011. Current pharmacological and phytochemical studies of the plant Alpinia galanga[J]. Journal of Chinese Integrative Medicine， 9（10）：1061-1065.

（责任编辑 罗 丽）