冠状动脉粥样硬化性心脏病血瘀证基因组学研究进展

陈　光　王　阶　高嘉良　董　艳

100053 北京，中国中医科学院广安门医院心血管科



冠状动脉粥样硬化性心脏病血瘀证基因组学研究进展

陈光王阶高嘉良董艳

100053 北京，中国中医科学院广安门医院心血管科

【摘要】冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)血瘀证基因组学水平的研究，主要涉及结构基因组学与功能基因组学。结构基因组学主要研究冠心病血瘀证相关基因的单核苷酸多态性。功能基因组学是从转录水平研究基因差异表达谱。该文主要介绍冠心病血瘀证基因组学研究进展、存在的问题和研究前景。

【关键词】冠状动脉粥样硬化性心脏病；血瘀证；基因组学；单核苷酸多态性；基因表达谱；证候

血瘀证是中医临床各科常见的一种证候。冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)最常见的证型之一即为血瘀证。基因组学(genomics)是阐明整个基因组的结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学，包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学。随着近年中医药研究现代化的进展，一些学者应用基因组学方法，从分子水平探讨冠心病血瘀证的证候实质，主要涉及结构基因组学和功能基因组学。

1结构基因组学

结构基因组学的主要内容是基因组作图和大规模测序。其中基因组作图主要包括限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列以及单核苷酸多态性(SNP)。目前对于冠心病血瘀证基因组学的研究主要涉及SNP。

1.1研究现状

对于冠心病血瘀证SNP的研究主要涉及PAF-AH基因、血小板膜糖蛋白Ⅲa基因、血管紧张素转换酶基因、血管紧张素原基因、肌细胞增强因子2A基因。研究显示，PAF-AH基因R92H、I198T多态性与冠心病血瘀证相关[1]。陈可冀院士团队的研究表明，血小板膜糖蛋白Ⅲa的PLA1/PLA2基因多态位点不是汉族人冠心病和冠心病血瘀证的危险因素[2]。李建军等[3]运用PCR结合琼脂糖凝胶电泳测定了119例冠心病血瘀证和41例非血瘀证患者血管紧张素转换酶基因多态性，发现冠心病血瘀证与该基因多态性无明显相关性(P>0.05)。胡志希等[4]运用PCR技术检测了41例早发冠心病血瘀证和45例非血瘀证患者血管紧张素转换酶基因多态性，发现该基因DD基因型及D等位基因与早发冠心病血瘀证发病相关(P<0.05)。李琳等[5]采用飞行时间质谱分析技术检测了25例早发冠心病血瘀证和30例非血瘀证患者血管紧张素转换酶基因和肌细胞增强因子2A基因的多态性，发现前者rs4293、rs4267385位点与冠心病血瘀证无关，rs4343与冠心病血瘀证相关(P<0.05)；未发现后者与冠心病血瘀证相关。袁倩等[6]运用飞行时间质谱分析技术和等位基因特异性PCR技术，检测了50例早发冠心病血瘀证和26例非血瘀证患者血管紧张素原基因rs4762和rs699位点多态性，发现这两个SNP位点与湖南地区人群早发冠心病血瘀证均有相关性(P<0.01)。

1.2存在问题解析

目前证候相关SNP的研究存在以下3个问题。第一，SNP位点丰富且分布广泛，选择待测基因与SNP位点难度较大，这也是导致结果阳性率低的原因之一。笔者认为，应结合目前血瘀证的相关机制，如微循环障碍、血液高凝状态、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、免疫功能障碍相关基因，探讨调节通路的上下游关系。例如，血浆同型半胱氨酸水平过高会引发动脉粥样硬化，这与血瘀证明显相关，而同型半胱氨酸甲基化反应需要关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶参与，N5,N10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因第4外显子的C677T碱基突变最为常见。胡木林等[7]选择该基因进行检测，发现MTHFR基因TT型可能是缺血性中风病血瘀证发病的易感危险因素之一。第二，目前各研究的样本量较小，且待测人群的特征是对照设计的关键点，进一步扩大样本量进行验证十分必要。第三，表型与基因型之间存在着“一对多”的关系，是预测高危SNP的理论基础。因此，检测单一基因的某一个位点远远不够，根据小样本多基因多位点的筛选结果进行扩大样本量验证，是解决方法之一。

1.3研究思路展望

根据中医理论思考SNP的特点，可以得出以下两点启示。第一，SNP是个体间存在先天性差异的重要遗传基础。一个人的体质很大程度上取决于先天因素，并体现在对某些疾病的易感性和对证候发生的倾向性。因此，SNP作为重要的内在遗传因素，可能是“血瘀体质”客观化研究取得进展的突破口。第二，中医学与基因组学在整体观的思维方式上是一致的，但中医证候的发生、发展复杂，全基因组关联分析(GWAS)也许可以为寻找与证候相关的遗传因素提供思路。然而，目前大部分研究是利用“人类基因组单体型图计划(HapMap)”中发现的SNP制作的芯片，但许多疾病是由稀有突变造成，芯片往往遗漏了这部分信息。因此，全基因组外显子测序，甚至完整的全基因组测序有待进一步利用。

2功能基因组学

功能基因组学的重要部分是转录组学。转录组学是在整体水平上研究细胞编码基因的转录情况及转录调控规律，阐明生物体在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA及其功能。2.1研究现状分析

目前冠心病血瘀证mRNA相关研究主要利用微阵列、基因表达系列分析、大规模平行信号测序系统等技术，对血瘀证与非血瘀证患者进行检测，试图发现差异基因表达谱。陈可冀院士团队[8]应用寡核苷酸基因芯片技术，分析了冠心病血瘀证、非血瘀证及健康人的基因表达谱差异，结果发现与血瘀证相关的差异基因有48个，其中上调基因26个，下调基因22个。王阶等[9-12]运用差异显示方法研究冠心病血瘀证患者外周血白细胞的mRNA,电泳结果显示出95条差异条带，通过反向Northern法验证差异条带，得出28个差异基因，并将其与美国国家生物技术信息中心(NCBI)人类基因库进行比对，获得了与人类基因100%同源的3个差异基因(b13、49b、23b)，99%同源的2个差异基因(b12、36a)，98%同源的2个差异基因(25b、57d)，其中b13与23b分别是淋巴细胞活化信号分子家族成员1(SLAMF1)与Bcl-2相关转录因子1(BCLF1)，临床验证发现，二者在冠心病血瘀证组中显著高表达。王萍等[13]采用表达谱芯片检测了16例冠心病血瘀证患者和7名健康人的差异基因表达谱，发现了与冠心病血瘀证相关的差异基因26个，其中上调7个，下调19个。袁肇凯等[14]采用基因芯片技术，检测了家系冠心病血瘀证、家系冠心病非血瘀证患者的差异基因表达谱，结果显示家系冠心病血瘀证相关的差异基因有8个，上调4个，下调4个， KEGG 通路分析显示差异主要涉及趋化因子、白细胞介素、补体系统、基质金属蛋白酶、成纤维细胞生长因子、内皮细胞黏附因子。

2.2存在问题解析

目前血瘀证基因表达谱研究尚存在以下4点问题。第一，小样本量芯片检测的个体差异较大，扩大样本量验证和配对样本设计较为关键。第二，冠心病血瘀证诊断标准和芯片技术不统一。统一诊断标准和芯片技术是整合各类研究的基础。第三，某一种芯片只能检测该芯片包含的捕获目标序列，对于其他基因的检测则存在盲点，这是芯片技术的缺陷之一。第四，单纯以基因表达谱研究血瘀证的实质存在还原论思维方法的局限性，对于差异表达谱的调节机制研究仍有必要，因为调节网络的构建是从分子层面选择预防和治疗疾病靶点的基础。

2.3研究思路展望

基因表达谱可以提供某种条件下各种基因表达的信息，通过表达序列标签(EST)技术推测相应未知基因的功能。然而，转录组学对整体功能的解释较为局限。合成生物学可以很好地解决这个问题[15]。合成生物学基于全基因组序列和“三大系统”(代谢途径、信号传导通路、基因表达调控网络)的研究成果，利用核苷酸序列合成技术，人工设计和制造生物系统，研究保证生物存活所必需的最小基因组，从而更深入地理解生命本质。

3中医证候本质研究

3.1目前观点分析

证候本质的研究历经了几十年的发展，累积了大量结果，但尚未出现学术界认同的证候诊断“金标准”。仍有学者认为证候并非客观存在，而是借助现象构造的模型，抽象思维并不能被实验性研究所证实[16]。另外，也有学者认为，证候的本质并不等同于证候的物质基础[17]。证候研究的过程中往往受到不同患者疾病差异的影响，而患者证候的复杂性、证候诊断标准的多样性、动物证候模型建立标准的不确定性，都是研究证候实质的难点。

3.2证候研究展望

针对证候实质研究的诸多问题与争议，笔者认为：病证结合证候实质研究，可以避免因为疾病本身的差异导致证候研究结果的不确定性。此外，基于标准化证候诊断积分的复杂证候配对样本试验，基于动物四诊信息采集的证候模型的标准建立，是使试验更加严密并得到国际认可的重要途径。

3.3基因组学前景

基因组学在整体观方面的优势为中医本质研究提供了平台。然而，证候本身还映射着患者所处的社会、环境、气候及其自身文化素养、性格情操等方面，基因组学研究是否可以满足证候更高层次解读的要求仍需要实践检验。

参考文献

[1]Zheng GH, Xiong SQ, Chen HY, et al. Associations of platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH) gene polymorphisms with circulating PAF-AH levels and risk of coronary heart disease or blood stasis syndrome in the Chinese Han population[J]. Mol Biol Rep ,2014,41(11):7141-7151.

[2]薛梅，陈可冀，殷惠军.汉族人血小板膜糖蛋白ⅢaPLA基因多态性与冠心病血瘀证的相关性[J]. 中西医结合学报,2009,7(4):325-329.

[3]李建军,宋曙霞,陈克芳,等.冠心病血瘀证与血管紧张素转换酶基因多态性和内皮型一氧化氮合成酶基因G894T变异的关系[J]. 环球中医药,2012,5(3):180-184.

[4]胡志希,胡思远,李琳,等.血管紧张素转换酶基因多态性对早发冠心病血瘀证的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志,2013,11(5):515-518.

[5]李琳.早发冠心病血瘀证与ACE、MEF2A基因单核苷酸多态性的相关性研究[D].湖南中医药大学,2014.

[6]袁倩,毛以林,李杰,等.湖南地区人群早发冠心病血瘀证与AGT基因多态性的关系[J]. 辽宁中医药大学学报,2015,17(4):58-61.

[7]胡木林,王忠,李涛,等. 缺血性中风血瘀证患者MTHFR基因多态性研究[J]. 中国中医药信息杂志,2009,16(3):16-18.

[8]马晓娟,殷惠军,陈可冀.血瘀证患者差异基因表达谱研究[J]. 中西医结合学报,2008,6(4):355-360.

[9]王阶,杨保林,姜燕. 冠心病血瘀证相关基因研究[J]. 世界科学技术,2005,7(1):16-19.

[10]王阶,姜燕,杨保林. 运用差异显示筛查冠心病血瘀证相关基因[J]. 中国中医药信息杂志,2005,12(2):84-85.

[11]杨保林,王阶,姜燕. 反向Northern筛查冠心病血瘀证差异片段[J]. 中国中医基础医学杂志,2004,10(9):29-30.

[12]杨保林,王阶,姜燕. 冠心病血瘀证相关基因b13的筛查和临床验证[J]. 中国中医基础医学杂志,2007,13(1):69-71.

[13]王萍,王丽萍,黄献平,等.冠心病血瘀证差异表达基因及其启动子甲基化状态的初步研究[J]. 中医杂志,2013,54(11):949-952.

[14]袁肇凯,王丽萍,黄献平,等.冠心病血瘀证遗传相关的差异基因筛选及其功能路径分析[J]. 中国中西医结合杂志,2012,32(10):1313-1318.

[15]中国生物技术发展中心.基因组学方法[M].北京：科学出版社，2012：4.

[16]邱鸿钟.中医证本质的现象学分析[J]．中医研究，2010，23(7)：1-3.

[17]李翠娟，巩振东.证本质研究的困惑与对策[J]．辽宁中医杂志，2009,36(4)：531-533.

(收稿：2015-10-29 修回：2016-02-03)

(本文编辑：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.003

通信作者：王阶，Email:wangjie0103@126.com

基金项目：国家自然科学基金(81473561)；国家科技部“重大新药创制”重大科技专项(2013ZX09301307)；国家科技部“重大新药创制”重大科技专项(2012ZX09102-201-006)