一测多评法测定天然辣椒碱中2种主要成分

李金芳，宋百灵，3，张　唯，李新霞，2*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830011；2.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐　830011；3.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐　830011)



一测多评法测定天然辣椒碱中2种主要成分

李金芳1，宋百灵1，3，张唯1，李新霞1，2*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐830011；3.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐830011)

摘要：目的建立以1种对照品同时测定天然辣椒碱中2种成分的质量评价方法。方法以辣椒辣素为对照，采用一测多评法，同时测定辣椒辣素和二氢辣椒辣素的含量。结果测得辣椒辣素与二氢辣椒辣素的相对校正因子为1.12，同时采用外标法和一测多评法测定样品中二氢辣椒辣素含量，采用t检验对二者测定值进行比较，二者之间无显著差异(P>0.05)；以辣椒辣素的保留时间为1.00，计算得二氢辣椒辣素的相对保留时间为1.355，相对保留时间及保留时间差的RSD均小于5%。结论采用一测多评法，以辣椒辣素为对照，利用相对校正因子可实现同时测定辣椒辣素和二氢辣椒辣素的含量。

关键词：辣椒辣素；二氢辣椒辣素；一测多评；HPLC；校正因子

辣椒碱类化合物(capsaicinoids)是辣椒的标志性成分，包括辣椒辣素、二氢辣椒辣素、降二氢辣椒辣素、高二氢辣椒辣素和高辣椒辣素等[1]。其中辣椒辣素和二氢辣椒辣素约占辣椒碱总量的90%[2]，二者含量因品种、产地、栽培环境的不同而存在差异，因此，辣椒辣素和二氢辣椒辣素的含量是辣椒品质评定的重要指标。

辣椒辣素(capsaicin)化学名为8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是一种含酚羟基的生物碱[3]，二氢辣椒辣素(dihydrocapsaicin，DHC)是辣椒辣素的氢化产物，二者含量高低影响其辣度。辣椒碱类化合物的主要药效有镇痛[4]、止咳[5]、抗疲劳、抗炎、杀菌、抗病毒[6-7]及对心血管和消化系统的保护作用等。近年来，研究发现高纯度的辣椒碱可以杀死癌细胞，减少细胞癌变[8-9]；高纯辣椒碱可以制成戒毒药物[10]。

天然药物有效成分多为类群，类群成分间存在某些内在关联，2006年，王智民等首次提出并建立了适合于中药特点的一测多评测定法(quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS)。一测多评法[11]：在一定的线性范围内成分的量(质量或浓度)与响应值成正比，使用多指标质量评价时，以样品中某一典型组分(易得、廉价、有效)为对照，建立其与其他组分(对照品难获得、不稳定或价格昂贵)的相对校正因子，依据相对校正因子推算样品中其他组分含量，并使其计算值与实测值符合定量方法学要求的一种方法。一测多评法已被2010年版《中国药典》收录，在多种中药质量评价研究中得到应用[12-14]。

美国药典收载了辣椒碱提取物、辣椒、辣椒油3个品种，分别以辣椒辣素、二氢辣椒辣素为对照品，采用HPLC法进行含量测定[15]。欧盟药典收载了辣椒、辣椒油、辣椒流浸膏、辣椒酊剂4个品种，均以辣椒辣素为对照品，采用HPLC法，测定总辣椒碱含量[16]。《中国药典》收载了辣椒品种，分别以辣椒辣素、二氢辣椒辣素为对照品，采用HPLC法测定总辣椒碱含量[17]。

本实验拟以辣椒辣素为对照品参考美国药典中辣椒碱的含量测定方法，采用一测多评法测定两者之间的相对校正因子，推算二氢辣椒辣素的含量，用于辣椒碱类物质的质量评价。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(1260，安捷伦科技有限公司)；分析天平(AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-Teledo集团)；超低有机物超纯水机(Milli-Q Reference，密理博中国有限公司)。

1.2试药辣椒碱(capsaicin，北京百灵威科技有限公司，质量分数为99%，批号LF400122)；二氢辣椒碱(dihydro capsaicin，质量分数为96%，批号1-LIV-100-1)；天然辣椒碱样品(自制)；乙腈(色谱纯，Sigma 有限公司)；甲醇(色谱纯，Sigma有限公司)；磷酸(西安化学试剂厂，分析纯，20090420)；水(超低有机物超纯水机制得)。

2方法与结果

2.1溶液的配制辣椒辣素对照品溶液：分别精密称取辣椒辣素对照品10.08 mg，加甲醇溶解并稀释至10 mL，作为对照品储备液(1.080 0 mg·mL-1)。

二氢辣椒辣素对照品溶液：精密称取二氢辣椒辣素对照品12.09 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，作为对照品储备液(0.483 6 mg·mL-1)。

混合对照品溶液:精密量取辣椒辣素对照品储备液1.00 mL和二氢辣椒辣素对照品溶液0.50 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得待测成分混合对照品溶液(C辣椒辣素=0.108 0 mg·mL-1；C二氢辣椒辣素=0.024 2 mg·mL-1)。

供试品溶液:分别精密称取样品26.2，26.1，26.0，25.4，25.0和25.4 mg，加甲醇溶解并稀释至25 mL，精密量取1 mL，加甲醇稀释至10 mL，得6份供试品溶液。

2.2方法学考察

2.2.1色谱条件色谱柱：苯基键合硅胶填充柱(Waters，XTerra Phenyl，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(40∶60)；柱温：30 ℃；检测波长：281 nm；进样量：20 μL[15]；分析时间：40 min。

2.2.2专属性及系统适用性实验分别取混合对照品溶液、供试品溶液各20 μL进样，色谱图见图1。

在采用的色谱条件下，混合对照品和供试品色谱图中辣椒辣素、二氢辣椒辣素和其他辣椒辣素类达到基线分离，分离度均大于1.5，理论板数大于5 000。

图1HPLC图a.对照品；b.供试品；1.辣椒辣素；2.二氢辣椒辣素；3.其他辣椒碱

Fig.1 The HPLC chromatograms

a.the mixed references；b.the test；1.capsaicin；2.dihydrocapsaicin；3.other capsaicin

2.2.3线性与范围及校正因子计算

2.2.3.1线性与范围分别精密吸取辣椒辣素对照品溶液和二氢辣椒辣素对照品溶液各0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20和1.40 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得标准系列质量浓度溶液，进样20 μL，记录峰面积。

分别以辣椒辣素对照品、二氢辣椒辣素对照品的质量浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程依次为：Y=11 552X+21.24，r=0.999 9；Y=10 270X+9.285，r=0.999 9。表明辣椒辣素在0.020 2～0.141 7 mg·mL-1范围内、二氢辣椒辣素在0.009 7～0.067 7 mg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.2.3.2校正因子计算以辣椒辣素为内标，按下式计算二氢辣椒辣素的校正因子，见表1。

式中As为内参物对照品峰面积，Cs为内参物对照品质量浓度；Ai为某待测成分对照品峰面积，Ci为某待测成分对照品质量浓度。结果显示，二氢辣椒辣素的平均校正因子为1.12，RSD为1.32%，符合要求[12]。

2.2.4稳定性实验取同一混合供试品溶液，分别于第0，4，8，12和24 h进样检测，记录峰面积并计算含量的RSD值，结果显示，辣椒辣素和二氢辣椒辣素含量的RSD分别为0.72%和1.29%，均小于5%，辣椒辣素和二氢辣椒辣素溶液在24 h内稳定。

2.2.5精密度分别吸取质量浓度为0.040 5，0.081 0和0.121 4 mg·mL-1的混合对照品溶液适量，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD值。结果显示，3种质量浓度辣椒辣素和二氢辣椒辣素峰面积的RSD依次为1.81%和1.89%，0.24%和1.57%，1.92%和0.30%，均小于5%，精密度符合要求[12]。

表1二氢辣椒辣素的校正因子

Tab.1 The correction factor of dihydrocapsaicin

编号AsCs/mg·mL-1AiCi/mg·mL-1fSi1260.90.0202110.10.00971.132484.00.0405211.30.01931.093716.60.0607301.50.02901.144959.90.0810404.40.03871.1351188.50.1012508.30.04841.1261431.20.1214604.90.05801.1371654.40.1417705.90.06771.12

注：Cs、Ci分别为辣椒辣素和二氢辣椒辣素的质量浓度；As、Ai分别为辣椒辣素和二氢辣椒辣素峰面积。

2.2.6重复性实验取供试品6份，按供试品处理方法制备样品，测定辣辣素和二氢辣椒辣素含量，并计算其RSD值。结果显示，辣椒辣素和二氢辣椒辣素含量的RSD分别为1.08%和1.78%，均小于5%，重复性符合要求[12]。

2.2.7加样回收率在已知含量的样品中分别加入相当于待测物含量的80%，100%和120%的对照品，加样回收率和RSD值见表2。结果显示，辣椒辣素和二氢辣椒辣素的加样回收率RSD均小于5%，加样回收率符合要求[12]。

表2加样回收率实验

Tab.2 The results of recovery test

编号辣椒辣素本底值/mg加入量/mg实测值/mg回收率/%二氢辣椒辣素本底值/mg加入量/mg实测值/mg回收率/%低0.03790.03460.0740104.50.008790.007740.0168103.60.13790.03460.0740104.30.008790.007740.0167102.30.03790.03460.0734102.50.008790.007740.0168103.3中0.03790.04320.080498.30.008790.009670.018499.50.03790.04320.079696.50.008790.009670.0188103.70.03790.04320.080899.20.008790.009670.0188103.8高0.03790.05180.0919104.10.008790.01160.020298.10.03790.05180.089198.80.008790.01160.0206101.80.03790.05180.088898.10.008790.01160.0208103.1RSD/%3.091.98

2.3一测多评方法的耐用性评价按一测多评法技术要求，按照2.2.1项下色谱条件，微调流动相比例、柱温、流速和检测波长，测定辣椒辣素和二氢辣椒辣素的含量，计算二氢辣椒辣素的校正因子，考察方法的耐用性，结果见表3。结果显示，流动相比例、柱温、流速和检测波长发生较小变化时，计算得二氢辣椒辣素校正因子RSD均小于5%，所建方法耐用性符合要求[12]。

表3耐用性实验结果

Tab 3 The results of durability test

考察项目Cs/mg·mL-1AsCi/mg·mL-1AifSiRSD/%A∶B35∶650.1081162.20.0242240.41.164.3640∶600.1081172.00.0242226.61.1645∶550.1081241.20.0242258.41.08柱温/℃250.1081226.90.0242256.41.074.59300.1081172.00.0242226.61.16350.1081235.60.0242258.61.07流速/mL·min-10.80.1081339.20.0242267.71.123.791.00.1081172.00.0242226.61.161.20.1081117.80.0242241.11.07检测波长/nm2790.1081111.40.0242226.11.102.732810.1081172.00.0242226.61.162830.1081101.80.0242222.11.11

注：Cs、Ci分别为辣椒辣素和二氢辣椒辣素的浓度；As、Ai分别为辣椒辣素和二氢辣椒辣素峰面积。

2.4待测组分色谱峰的定位(专属性)专属性用各组分保留时间及相对保留时间差表示。以辣椒辣素的保留时间为1.00，计算二氢辣椒辣素的相对保留值及二者的保留时间差。见表4。

相对保留值r二氢辣椒辣素/辣椒辣素=

tR二氢辣椒辣素/tR辣椒辣素

保留时间差ΔtR=t二氢辣椒辣素-tR辣椒辣素

结果表明,二氢辣椒辣素的相对保留时间及二者的保留时间差的RSD均小于5%，符合要求[12]。

表4各组分的相对保留时间及保留时间差

Tab.4 The relative retention time and the retention time difference of each component

编号tR辣椒辣素tR二氢辣椒辣素r二氢辣椒素/辣椒辣素ΔtR113.29418.0101.3554.716213.30218.0201.3554.718313.31418.0361.3554.722413.30718.0261.3554.719513.30718.0261.3554.719613.29518.0081.3544.713RSD/%0.030.06

2.5样品测定分别精密吸取混合对照品溶液、辣椒辣素对照品溶液、供试品溶液各20 μL，进样。采用外标一点法测得辣椒辣素和二氢辣椒辣素含量分别为0.733 8和0.171 2 g·g-1，一测多评法计算供试品中二氢辣椒辣素的含量为0.171 3 g·g-1。采用SPSS 17.0软件，对二氢辣椒辣素的外标法测定值和一测多评法计算值作t检验分析，结果P>0.05，说明采用一测多评法计算的二氢辣椒辣素的含量与实测含量没有显著性差异。

3讨论

本实验利用一测多评法对天然辣椒素中辣椒辣素和二氢辣椒辣素进行含量测定。以辣椒辣素为内参物，计算二氢辣椒辣素的相对校正因子，并利用相对校正因子计算其含量。对二氢辣椒辣素的测定值和计算值作t检验分析，结果表明，一测多评法计算的二氢辣椒辣素的含量与实测含量没有显著性差异，说明建立的相对校正因子具有较高的可信度。

一测多评法可简化操作，其最大优势在于节省对照品，可作为新的质量评价模式用于辣椒辣素类物质的质量评价。

参考文献：

[1]吴波，谭文界. 辣椒辣素的分离纯化及分析[J].广州医学院学报，2002，30(4)： 42-44.

[2]王旭，王富华，钟红舰，等. 高效液相色谱法测定食品中的辣椒素、二氢辣椒素[J].食品科学，2008，29(7)：378-381.

[3]苏良飞，周仲承，王克军，等. 天然辣椒碱提取方法研究进展[J].西北药学杂志.2010，25(4)：46-47.

[4]Luvisetto S，Vacca V，Cianchetti C. Analgesic effects of botulinum neurotoxin type A in a model of allylisothiocyanate-and capsaicin-induced pain in mice[J]. Toxicon，2015，94: 23-28.

[5]Ternesten-Hasseus E，Johansson E L，Millqvist E. Cough

reduction using capsaicin[J]. Respir Med，2015，109(1): 27-37.

[6]刘芳. 辣椒辣素外涂治疗带状疱疹体会[J]. 求医问药，2011，9(7)：218.

[7]Dr G Goβrau.Postzosterneuralgie[J].Der Schmerz，

2014，28(1)：93-104.

[8]袁尼，朴花子. 辣椒素的抗肿瘤作用研究进展[J]. 延边大学医学学报，2011，34(1)：68-71.

[9]Wutka A,Palagani V,Barat S,et al.Capsaicin treatment

attenuates cholangiocarcinoma carcinogenesis[J].PLoS One，2014，9(4)：e95605.

[10]席改卿，王建森，王胜利，等. 辣椒碱的提取及其应用研究进展[J]. 中国农学通报，2012，28(6)： 222-226.

[11]王智民，钱忠直，张启伟，等. 一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志，2011，36(6)：657-658.

[12]王智民，高慧敏，付雪涛，等. 一测多评法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志， 2006. 31(23)：1925-1928.

[13]杨东亮，马桂芝，王娟，等. 一测多评法测定杜麻颗粒中5种成分的含量[J].西北药学杂志，2015，30(3)：247-251.

[14]高慧敏，宋宗华，王智民，等．适合中药特点的质量评价模式：QAMs研究概述[J]．中国中药杂志，2012，37(4)：405-416．

[15]Aas P G F， Bs M M R， Bspharm N R G. Achievement of USP chapter 797 compliance by a 35-bed rural hospital: A case study[S]. Int J Pharm Compd，2007， 11(6): 450-470.

[16]European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care.European Pharmacopoeia[S].2014，8.0:1194-1199.

[17]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：347-348.

Determination of two main ingredients in natural capsaicin extract by quantitative analysis of multi-components with a single-marker

LI Jinfang1，SONG Bailing1,3，ZHANG Wei1，LI Xinxia1,2*

(1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China； 2.Central Laboratory， Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3. Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Limited Company，Urumqi 830011，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for determination of two components in natural capsaicin by one reference substance. MethodsQuantitative analysis of multi-components was performed to determine the contents of dihydrocapsaicin and capsaicin with capsaicin as the reference substance by single-maker(QAMS) and HPLC. ResultsThe relative correction factor between capsaicin and dihydrocapsaicin was 1.12. There was no significant difference of the measured values between the external standard method and QAMS (P>0.05). With capsaicin retention time of 1.00， the relative retention time of dihydrocapsaicin was 1.355 and the RSD was less than 5%.ConclusionWith capsaicin as a single marker and the relative correction factor of dihydrocapsaicin，QAMS could be applied for the determination of the main components of natural capsaicin extract simultaneously.Key words: capsaicin；dihydrocapsaicin；quantitative analysis of multi-components by single-maker(QAMS)； HPLC；correction factor

(收稿日期：2015-06-23)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0251-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.009

*通信作者：李新霞，女，教授，博士生导师

作者简介：李金芳，女，在读硕士研究生

基金项目：国家自然科学基金项目(编号：81260486)