HPLC法测定养阴清肺口服液中芍药苷的含量

高鸿彬，傅　芃，王晓君，王志君，胡叶帅，陈方剑，宋洪杰

(第二军医大学长海医院药学部，上海　200433)



HPLC法测定养阴清肺口服液中芍药苷的含量

高鸿彬，傅芃，王晓君，王志君，胡叶帅，陈方剑，宋洪杰*

(第二军医大学长海医院药学部，上海200433)

摘要：目的建立HPLC法测定养阴清肺口服液中芍药苷的含量。方法采用高效液相色谱法。色谱柱：CNW Athena 120A C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(12∶88)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；进样量：20 μL。结果芍药苷在0.593 75～38 μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.999 99)，平均回收率为99.74%，RSD为2.21%(n=6)。结论该方法准确、灵敏，专属性强，重复性好，对养阴清肺口服液质量控制标准的提高具有参考意义。

关键词：养阴清肺口服液；芍药苷；高效液相色谱法

养阴清肺口服液是由玄参、地黄、牡丹皮、白芍等8味药材组成的自制纯中药复方制剂，临床疗效显著，可抗菌消炎、提高免疫力，主要用于咽喉干燥疼痛、干咳，可改善少痰或无痰等症状[1]。白芍能养血滋阴、止痛护肝，牡丹皮能清热凉血、退虚热，是该复方制剂的主药，现行药品质量标准控制水平较低，没有芍药和牡丹皮中芍药苷的含量测定方法。文献报道一般采用高效液相色谱法测定[2-12]。为保证其质量安全可控，本研究以反相高效液相色谱法，建立了我院自制制剂养阴清肺口服液中指标性成分芍药苷含量的检测方法，为其质量标准提供实验依据。

1仪器与试药

1.1仪器岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BT124S电子分析天平(北京Sartorius有限公司)；DL-720A 型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。

1.2试药养阴清肺口服液(第二军医大学长海医院药学部自制，批号:140917，141119和150211)；芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110736-201438，含量以96.4%计)；乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为蒸馏水。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：CNW Athena 120A C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(12∶88)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：230 nm；进样量：20 μL。

2.2对照品与供试品溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取芍药苷对照品，以体积分数为50%的甲醇定容配制成95 μg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.2.2供试品溶液精密量取养阴清肺口服液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，加入体积分数为50%的甲醇40 mL，超声处理30 min，放冷，用体积分数为50%的甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液取不含白芍和牡丹皮的阴性对照样品，按照供试品溶液配制方法同法制备阴性对照溶液。

2.3专属性实验按照上述色谱条件，依次精密吸

取对照品、供试品和阴性对照溶液各20 μL进样测定。结果表明，对照品和供试品溶液色谱图在相应位置上，出现相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液色谱图在此处则无吸收峰，表明专属性良好，结果见图1。

图1HPLC图

A.对照品溶液；B.样品溶液；C.阴性对照溶液；1.芍药苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.paeoniflorin

2.4标准曲线的制备分别精密量取2.2.1项下的芍药苷对照品溶液适量，用体积分数为50%的甲醇稀释，得到系列质量浓度为0.593 75，1.187 5，2.375，4.75，9.5，19和38 μg·mL-1的溶液。按照本实验的色谱条件，进样20 μL，测定峰面积值，以对照品溶液的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归。线性方程：Y=24 587X-2 139，r=0.999 99。结果表明，芍药苷在0.593 75～38 μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.5精密度实验精密吸取芍药苷对照品溶液20 μL，按照2.1项下色谱条件重复进样6次，按照峰面积计算芍药苷的日内精密度RSD为0.44%(n=6)。精密吸取同一对照品溶液20 μL，每天进样1次，连续进样5 d，记录峰面积，计算得到芍药苷的日间精密度RSD为0.91%(n=5)，表明仪器的精密度达到检测要求。

2.6检测限的确定取2.2.1项下的对照品溶液进行逐步稀释，以S/N=3∶1计算，得到芍药苷的最低检测限为1.19 ng。

2.7稳定性实验按照2.2.2项下供试品溶液制备方法制备批号为150211的供试品溶液，依次在0，1，2，4，6和8 h分别进样，将峰面积数值代入回归方程计算，供试品中芍药苷含量的RSD为1.96%(n=6)，结果显示，上述溶液在8 h内稳定。

2.8重复性实验取养阴清肺口服液相同批号的样品6份，按照2.2.2项下供试品溶液制备方法制备供试品，记录峰面积，计算得芍药苷RSD分别为0.86%(n=6)，结果显示，该方法的重复性符合检测要求。

2.9加样回收率实验精密量取已知芍药苷含量的养阴清肺口服液0.5 mL(批号150211，芍药苷含量约为0.750 mg·mL-1)，平行操作6份，分别精密加入芍药苷含量为95 μg·mL-1的对照品溶液4 mL。按照2.2.2项下方法操作并测定含量，计算样品的加样回收率。结果显示，芍药苷的平均回收率为99.78%，(RSD=2.17%，n=6)，见表1。

表1养阴清肺口服液中芍药苷加样回收率实验结果

Tab.1 Recovery test results of paeoniflorin

(n=6)

2.10样品含量测定取3个批号养阴清肺口服液，按照供试品溶液的处理方法同法制备，按照2.1项下的色谱条件，测定峰面积值，代入回归方程计算样品中芍药苷的含量，结果见表2。

表2养阴清肺口服液中芍药苷的含量测定结果

Tab.2 Determination results of paeoniflorin in Yangyinqingfei Oral Liquid

(n=3)

3讨论

3.1检测波长的选择通过紫外扫描结果发现，芍药苷在230 nm附近有最大吸收，本研究选择230 nm为检测波长。

3.2流动相的选择曾用乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(14∶86)、乙腈-水(11∶89)、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)等溶剂系统和比例进行比较，结果显示，乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)作为流动相时所得峰形对称，分离效果好，干扰成分少，保留时间适宜，作为最终的流动相条件。

3.3提取条件的选择本制剂由于是水溶液，结合芍药苷易溶于甲醇的特点，通过考察不同的提取溶剂如稀乙醇和体积分数为50%的甲醇及提取时间、提取方法等因素对指标性成分含量的影响，最终确定提取条件为：体积分数为50%的甲醇，超声提取30 min，此条件可达到最佳提取效果。

3.4结果分析测定结果显示，不同批号的养阴清肺口服液中芍药苷的含量存在较大差异。这是由于不同批次的药材，其产地、采收期、干燥方法、加工炮制方法及贮存条件不同所致；另外制剂本身的贮存时间也会使含量存在一定的变化。因此，对其中芍药苷含量范围的确定仍需进一步跟踪研究。

本文建立的HPLC法测定养阴清肺口服液中芍药苷的含量，方法简便，专属性强，结果准确、可靠，为完善养阴清肺口服液的质量控制研究提供一定的参考依据。

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Determination of paeoniflorin in Yangyinqingfei Oral Liquid by HPLC

GAO Hongbin，FU Peng，WANG Xiaojun， WANG Zhijun，HU Yeshuai，CHEN Fangjian，SONG Hongjie*

(Department of Pharmacy， Changhai Hospital， the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract:ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of paeoniflorin content in Yangyinqingfei Oral Liquid. MethodsHPLC method was used in this study，with CNW Athena 120A C18(150 mm×4.6 mm，5 μm) as the chromatographic column， acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (12∶88) as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was 230 nm and the injection volume was 20 μL. Results Paeoniflorin showed a good linear relationship within the range of 0.593 75-38 μg·mL-1(r=0.999 99)，and the average recovery rate was 99.74% with RSD of 2.21%(n=6).ConclusionThe established HPLC method is accurate，sensitive，specific and reproducible.It could be used for the quality control of Yangyinqingfei Oral Liquid.

Key words:Yangyinqingfei Oral Liquid；paeoniflorin；HPLC

(收稿日期：2015-07-23)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0254-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.010

*通信作者：宋洪杰，女，副主任药师

第一作者简介：共同高鸿彬，男，主管药师;

基金项目：军队医疗机构制剂标准提高计划科研专项课题(编号:14ZJZ0-3)

傅芃，女，副主任药师