NC膜富集法、实时荧光PCR法、培养法检测志贺菌的比较研究

韦婕,郭欣欣,梁君瑜,吴英松，刘天才

(1.南方医科大学生物技术学院，广东 广州 510515；2.中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120)



NC膜富集法、实时荧光PCR法、培养法检测志贺菌的比较研究

韦婕1,2,郭欣欣1,梁君瑜1,吴英松1，刘天才1

(1.南方医科大学生物技术学院，广东 广州 510515；2.中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120)

摘要：观察、比较硝酸纤维素膜富集法、实时荧光PCR法及传统培养法对志贺菌阳性检出率的不同.对137例临床样本分别采用硝酸纤维素膜富集法、实时荧光PCR法、传统培养法进行检测.3种方法检测结果阳性率分别为13.14%、20.44%、8.03%.硝酸纤维素膜富集法是在培养法基础上进行了一些改进，采用“先分离再培养”的方法，与传统培养法比较，检测结果阳性率明显提高，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05).另一方面，硝酸纤维素膜富集法耗时较短，特异性高，成本低并且无需特殊设备，特别适宜基层检测单位和健康筛查单位使用.实时荧光PCR法检测结果阳性率最高，但同时假阳性率也最高.传统培养法检测结果阳性率最低，但现今在临床工作中仍以传统培养法作为志贺菌检测的标准方法.研究结果显示，硝酸纤维素膜富集法检测志贺菌，明显提高了检测结果的阳性率，且特异性高、耗时较短，具有很好的临床应用前景.

关键词：硝酸纤维素膜富集法；志贺菌；培养法

0引言

志贺菌是人类主要的肠道病原菌之一，可引起人类细菌性痢疾[1].其传染源有细菌性痢疾病人、恢复期带菌者、慢性带菌者和健康带菌者.该病菌主要通过粪-口途径传播，引起的细菌性痢疾多数为散发病例，偶尔因其污染的水和食物而引起爆发流行，任何季节均可发病.痢疾志贺菌引起的菌痢特别严重，死亡率较高.其他种属志贺菌引起的感染相对较轻，预后较为良好，但是急性感染者若治疗不及时或者治疗不彻底，可以转变为慢性[1].一些非典型菌痢由于症状不典型，极易造成误诊和漏诊.因此，及时、准确检测病原菌为临床诊治提供明确检验结果就显得非常重要且必要.

目前检测志贺菌的方法众多[2-3]，如分子生物学技术、免疫学技术等都应用于志贺菌的检测，这些方法虽然有一定的优势，如检测灵敏度高、检测快速等等，但不管何种方法检测出来的阳性结果，最终均需要通过分离培养与鉴定，也就是国标法进行确证.而传统的培养法耗时长且检测阳性率低.因此为了提高传统培养法的阳性检测率，我们在传统培养法的基础上，建立了硝酸纤维素膜富集法(以下简称NC膜富集法)检测志贺菌.NC膜富集法的基本原理是利用抗原抗体特异结合的特性，用包被好志贺菌特异抗体的硝酸纤维素膜富集样本中的志贺菌，将志贺菌从复杂的粪便环境中纯化出来，然后再进行后续的增菌培养鉴定.本文中用新建立的NC膜富集法与实时荧光PCR法、传统培养法对临床样本进行检测，实验数据表明，新建立的NC膜富集法对志贺菌的阳性检出率明显提高，从而大大减少了其漏检率，在临床检验领域有着广泛的应用前景.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样本本实验采用的是主诉为“腹泻”的临床标本137例，标本采集后，均在2 h内进行检测.

1.1.2试剂沙门氏菌-志贺氏菌琼脂培养基(以下简称SS培养基)，购自安图生物；营养肉汤，购自杭州天和微生物试剂有限公司；硝酸纤维素膜，购自Millipore公司；志贺氏菌多价诊断血清，购自宁波天润(注册号：国食药监械(准)字2009第3400957号)；沙门志贺氏菌PCR检测试剂盒，购自深圳市生科源技术有限公司.所有试剂均在有效期内使用.

1.1.3主要仪器恒温培养箱，上海博迅公司，BSP-250；实时荧光PCR仪，MX3005P(Stratagene).

1.2实验方法样本处理：取1 g新鲜采集粪便标本放入9 mL营养肉汤中，用振荡器混匀.取1 mL进行实验.每份样本分成3组，每组重复3管.分别用NC膜富集法、实时荧光PCR法、传统培养法进行检测.

1.2.1NC膜富集法检测

1) 拭子条制备：将剪裁好的硝酸纤维素膜置于1 mL志贺氏菌多价诊断血清试管中包被30 min，取出后置于10%胎牛血清中4 ℃过夜封闭，再将包被好后的硝酸纤维素膜固定于拭子条上.

2) 硝酸纤维素膜富集标本中的志贺菌：将包被了志贺菌抗体的硝酸纤维素膜拭子条一端浸入待测标本管中，放置于37 ℃水浴箱富集30 min.

3) 取出拭子条,用营养肉汤冲洗3次，置于新的营养肉汤管中增菌3 h.

4) 取出拭子条后再次用营养肉汤冲洗3次，富集完成后的硝酸纤维素膜拭子条直接涂布于SS选择培养基上.

1.2.2实时荧光PCR法检测

1) PCR反应 采用25 μL反应体系：PCR反应液19.5 μL，混合酶液0.5 μL，样本模板5 μL；PCR循环参数：UNG处理，50 ℃ 2 min；预变性95 ℃ 3 min；后续循环95 ℃ 5 s，55 ℃ 60 s，40个循环.

2) PCR法检测志贺菌取1 mL处理好的样本，取样本经自然沉降后的上清液，用12 000 r/min 离心5 min后弃去上清保留沉淀，加入DNA提取液50 μL，悬浮后100 ℃加热处理5 min，再次12 000 r/min 离心2 min，取上清液做为样本模板.按照1)方法进行PCR反应.

1.2.4结果综合判断3管重复样本大于等于两管阳性则结果判为阳性，大于等于两管阴性则判为阴性.

1.2.5统计方法两种方法阳性率比较采用配对x2检验.

2结果与分析

2.1137例临床标本NC膜富集法检测阳性18例，阳性检出率为13.14%；实时荧光PCR法检测阳性28例，阳性检出率为20.44%；传统培养法检测阳性11例，阳性检出率为8.03%.

表1　NC膜富集法、实时荧光PCR法、

3种方法检测结果实时荧光PCR法阳性率最高，传统培养法阳性率最低.3种方法阳性检出率结果见表1.

2.2137例临床标本NC膜富集法与实时荧光PCR法两法检测均阳性18例；NC膜富集法检测阳性、实时荧光PCR法检测阴性0例；NC膜富集法检测阴性、实时荧光PCR法检测阳性10例；两者均阴性109例.NC膜富集法阳性率13.14%，PCR法阳性率20.44%，经x2检验,两方法阳性率差异有统计学意义(P=0.002 < 0.05)，结果见表2.

表2NC膜富集法、实时荧光PCR法检测结果比较

(n=137)

PCR法NC膜富集法+-合计+181028-0109109合计18119137

表3NC膜富集法、传统培养法检测结果比较

(n=137)

国标法NC膜富集法+-合计+11011-7119126合计18119137

2.3137例临床标本NC膜富集法与传统培养法两法检测均阳性11例，NC膜富集法检测阳性而传统培养检测阴性7例，NC膜富集法检测阴性、传统培养法检测阳性0例，两者均阴性119例.NC膜富集法检测阳性率13.14%，传统培养法检测阳性率8.03%，经配对x2检验,两方法阳性率差异有统计学意义(P=0.016 < 0.05)，结果见表3.

3讨论

本研究同时用NC膜富集法、实时荧光PCR法、传统培养法对相同样本进行检测，3种方法的阳性检出率分别为13.14%、20.44%、8.03%，高于文献报道的志贺菌阳性检出率[4-7]，这与标本选择有关，因为我们采用的标本是主诉为“腹泻”的标本，符合志贺菌引起的细菌性痢疾症状，因此，相对于大多数文献报道的大量体检标本或者入院常规检查标本阳性检出率明显偏高.

我们建立的NC膜富集法是在传统培养法的基础上，利用抗原抗体特异性结合的原理，将要检测的志贺菌通过包被了特异抗体的硝酸纤维素膜拭子条先富集，将标本中的志贺菌尽可能地从复杂的粪便环境中纯化出来，然后再进行增菌和分离检测.通过富集作用后，在去除了样本中大量杂菌的情况下，减少了杂菌的“营养竟争”抑制作用，使志贺菌在检测环境中由原来的相对劣势菌成为优势菌，也就是提高了志贺菌的检测浓度，从而大大提高检测阳性率.

研究数据结果显示，NC膜富集法与实时荧光PCR法比较，两者检测志贺菌的阳性率经配对x2检验显示,两方法阳性率差异有统计学意义(P=0.016<0.05)， NC膜富集法检测阳性率低于实时荧光PCR法；虽然如此， NC膜富集法与传统培养法比较，两者的检测阳性率经配对x2检验结果显示两方法检测阳性率差异有统计学意义(P=0.002<0.05)，结果证明NC膜法较之于传统培养法，志贺菌的检出率显著提高.同时这个结果也说明，实时荧光PCR法虽然检测灵敏度很高，但存在一定的假阳性.而传统培养法检测为阳性的11例标本，用NC膜富集法进行检测，结果也全部显示为阳性，证明NC膜富集法检测志贺菌的特异性很高，未发现有假阳性结果.另一方面，NC膜富集法检测志贺菌，增菌时间仅需3 h就可以达到良好的检测效果，与传统培养法比较，检测时间明显缩短，大大提高了检测效率，这在临床检测工作中节约了更多的时间成本，可以更快为临床提供准确的检验报告.

实时荧光PCR法是对食品相关从业人员以及幼教从业人员常用的筛查方法[8-9]，由于其操作相对简单、快速，并且可以批量进行检测[8,10-11]，因此也是体检样本以及食品、水源污染的首选常用检测方法.实时荧光PCR法灵敏度高，可以最大程度避免漏检.但同时，它的假阳性率也较高，这个缺点也制约了实时荧光PCR法的临床应用.在临床工作中，实时荧光PCR法检测结果为阳性的样本需经过传统培养法进行确证.而传统培养法受标本中杂菌或者其他干扰物质的“营养竟争”影响[8]，导致其阳性检出率低，特别是对于样本中志贺菌浓度低的样本.而多数从事餐饮、食品加工及幼师等的从业者，即便是通过PCR法筛查为阳性，往往也是健康的带菌者，其粪便中志贺菌浓度很低，在用传统培养法进行检测时结果多数为阴性，导致两种方法检测相符率非常低.而NC膜富集法在培养法基础上进行了改进，可以明显提高检测结果的阳性率，因此，若实时荧光PCR法检测筛查为阳性的标本，再使用本研究建立的NC膜富集法进行确证，可显著提高检测结果的相符率，大大减少了漏检率，为临床提供更为快速、准确的检验报告.

NC膜富集法由于暂无标准试剂盒，志贺菌多价血清包被的硝酸纤维素膜需自行制备，暂时难以做到标准化.尽管如此，从本研究的结果数据看来，NC膜富集法较之于传统培养法已经显示了明显的优越性，并且其操作简单、成本低廉、无需特殊设备，在显著提高阳性检出率的基础上明显缩短检测时间，值得进一步规范化推广，并应用于临床粪便样本志贺菌的检测.

4参考文献

[1] 张卓然，倪语星.临床微生物学和微生物检验[M].3版.北京：人民卫生出版社，2004:118-119.

[2] 李劲锋.志贺菌检验技术的研究进展[J].职业与健康,2014,30(13):1874-1877.

[3] 罗宇鹏.不同方法检测食源性致病菌的对比研究[J].国际检验医学杂志,2015(7):918-919,922.

[4] 江倔,李真,吴改玲,等.门诊细菌性痢疾志贺菌检测结果分析[J].中国全科医学，2010,13(1):47-49.

[5] 田忠梅,赵伟.致腹泻病原菌的检测分析[J].中华医院感染学杂志，2008，18(5)：664.

[6] 吴海娟.实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析[J].现代预防医学,2013,40(12):2323-2325.

[7] 陈铭,于艳华,张立丽,等.肠道门诊165例腹泻患者的病原菌及流行病学分析[J].中华医院感染学杂志,2011,21(11):2247-2248.

[8] 褚国方,张月娟,李明珠,等.Real-time PCR技术与传统培养法检测肠道沙门菌和志贺菌的比较[J].中国卫生检验杂志,2007,17(8):1458-1460.

[9] 贺电,张晓曦,单志兰,等.PCR检测技术在志贺菌引起的腹泻疫情中的应用[J].中国卫生检验杂志,2007,17(5):858-860.

[10] 杨小蓉,赵晋,张元群,等.PCR检测粪便中志贺菌[J].预防医学情报杂志,2008,24(11):913-915.

[11] 陈红远,钟青萍,王丽,等.PCR技术快速检测痢疾志贺菌的研究[J].卫生研究,2010,39(5):597-600.

(责任编辑游俊)

Comparative study on the detection of Shigella with NC membrane enrichment method,real-time PCR method and culture method

WEI Jie1,2,GUO Xinxin1,LIANG Junyu1,WU Yingsong1,LIU Tiancai1

(1.School of Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2.Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,China)

Abstract:Nitrocellulose membrane enrichment method,real-time PCR method and the culture method were employed to detect Shigella of 137 clinical samples.Observed the positive detection rate of the three methods.The positive detection rate of the three methods were as follows:13.14%,20.44%,8.03%.Based on the culture method,the nitrocellulose membrane enrichment method made some improvements and adopted the method of “separation first,then culture”.Compared with the culture method,the positive rate was increased obviously,the two groups had statistical significance (P<0.05).On the other hand,the nitrocellulose membrane enrichment method had short testing time,highly specific and highly positive rate and a lower cost.In addition,this method does not need specific installation and technology,so it has certain clinical application value,particularly suit for the primary medical units and the health examination management centers.The highest positive rate was the real-time PCR method,but aslo the false positive result was the highest.The lowest positive rate was the culture method,but nowadays the culture method is still as the gold standard to detect Shigella.The results showed that,the nitrocellulose membrane enrichment method had the advantages of high specificity and short testing time,this method had bright clinical applied prospect.

Key words:nitrocellulose membrane enrichment method; Shigella; culture method

中图分类号:Q93-332;R446.13

文献标志码:A

DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2016.03.018

文章编号:1000-2375(2016)03-0271-04

作者简介：韦婕(1984-)，女，主管技师；刘天才，通信作者，博士，研究员，E-mail:liutc@smu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(21575058)资助

收稿日期:2015-08-27