木质素合成酶基因反义COMT对亚麻的转化及检测

黄文功，康庆华，姜卫东，姚玉波，詹亚光

(1.东北林业大学，哈尔滨150040；2.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)



木质素合成酶基因反义COMT对亚麻的转化及检测

黄文功1,2，康庆华2，姜卫东2，姚玉波2，詹亚光1*

(1.东北林业大学，哈尔滨150040；2.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)

摘要：COMT基因主要参与S木质素的生物合成，转基因植物在COMT活性被抑制时，木质素含量减少，利用杨树皮储藏蛋白(BSP)启动子和该基因构建成反义植物表达载体pBSP-antiCOMT-2301，利用农杆菌介导法将其转入亚麻，经过卡那霉素筛选获得了抗性的愈伤组织，诱导分化后获得了亚麻苗。经特异引物的PCR扩增，证明目的基因已经整合到亚麻基因组中，本研究获得的阳性转基因亚麻植株为亚麻纤维研究及品种选育奠定了坚实基础。

关键词：亚麻；咖啡酸-O-甲基转移酶基因；遗传转化

亚麻纤维强韧、柔细，具有较好的色泽，织物平滑整洁，亚麻纺织品以其独特的优良品质受到广大消费者的青睐。纺织工业利用的是亚麻韧皮纤维，原麻需经过脱胶后才能用于纺织，亚麻胶质中木质素是亚麻脱胶过程中最难去除的成分，原麻中的木质素含量高不仅使得脱胶的成本大大提高，污染严重，同时，由于木质素在原麻脱胶过程中难以去除，造成亚麻服装穿着有刺痒感，严重影响了亚麻织品的质量。因此，降低木质素含量以提高纤维品质，已成为发展亚麻产业急待解决的重大课题。目前也有对脱胶后的精麻进行酶处理以降低木质素提高纤维的可纺性能等方面的报道，但效果并不理想，通过品种改良从源头上降低亚麻纤维中的木质素含量，是解决这一难题最为经济有效的办法。

国际上通过转基因技术调控植物木质素含量与组分已成为热点。木质素生物合成途径的基础研究也进展迅速，国内外研究人员已分离克隆了多个木质素生物合成途径中的关键酶基因，并构建了单价与双价反义表达载体，得到木质素含量下降或木质素组分改变的转基因植物[1-4]。近年来，利用反义RNA技术转化植物得到了木质素含量和化学组分改变的植物，涉及的植物包括拟南芥、烟草、百日草、杨树、火炬松等[4]。COMT主要参与S木质素的生物合成[5]。在杨树[6]、烟草[7]、苜蓿[8]、火炬松[9]中都有正义或反义抑制COMT活性的报道。转基因植物在COMT活性被抑制到足够低时，木质素含量减少。目前国内外关于COMT基因降低亚麻木质素含量的研究还未见报道。

植物木质素代谢关系到纤维的产量和质量问题，研究韧皮纤维植物的木质素代谢利于定向改良纤维品质[10]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与质粒

质粒pBSP-antiCOMT-2301由中国热带农业科学院热带生物技术研究所的郭安平研究员馈赠，土壤农杆菌LBA4404由黑龙江省农业科学院经济作物研究所实验室保存。

1.1.2植物材料

亚麻是当前主要推广栽培品种“黑亚14号”。

1.1.3酶与试剂

Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；MS盐购自Invitrogen 公司；DL3000购自Takara公司；DNA Plant Mini Kit试剂盒购于天根公司。

1.1.4引物

在检测阳性植株时所用引物为P1:5’-GCGACTAGTATGGGATCCAGTGAGA CT-3’，P2:5’-GCGCCCGGGTCAAGGCTTCTTGAGAAACTCC-3’，扩增到大小约1.1 kb的产物。

1.2方法

1.2.1植物表达载体pBSP-antiCOMT-2301导入农杆菌及转化子的鉴定

农杆菌LBA4404感受态细胞的制备和电击法将pCAM2301BSPantiCOMT转化农杆菌均参照分子克隆第三版[11]。

1.2.2农杆菌介导法转化亚麻

通过抗生素浓度的筛选、农杆菌菌液浓度及侵染时间的选择、共培养温度和共培养时间确立等方面研究，建立高效转化体系：外植体材料下胚轴，抗生素卡那霉素(100 mg/L)，农杆菌菌液OD600值0.6，侵染40 min，共培养温度28℃，共培养时间为72 h。

1.2.3转基因亚麻的PCR检测

取转基因亚麻和对照亚麻嫩叶，采用天根公司DNA Plant Mini Kit试剂盒提取基因组DNA，作为PCR反应模板。以P1、P2为引物，PCR检测转基因情况。

2结果

2.1植物表达载体pBSP-antiCOMT-2301导入农杆菌及转化子的鉴定

植物表达载体pBSP-antiCOMT-2301(图1)。取出一管分装好的农杆菌感受态细胞冰浴融化，将电击杯(存于70%乙醇中)在超净工作台上吹干，然后在冰浴预冷，在灭菌1.5 mL Ep管中加1 mL YEB，感受态融好后，加<1 μL的质粒pCAM2301BSPantiCOMT，混匀，将含质粒的感受态加入电击槽，电击仪上电击2.5 KV × 5 ms(EQUIBIO)，立即加入准备好的1 mL YEB，枪头吹打动作要轻，吸出放回Ep管中，28℃、100 rpm摇菌复苏1 h，涂于YEB平板(取100～200 μL)，28℃，倒置培养48～72 h。挑取单菌落，做菌落PCR。以引物P1， P2进行PCR操作。电泳检测已扩增到COMT，其大小约为1.1 kb，电泳结果如图2，进而确定植物表达载体已导入农杆菌。

1：DL3000 Marker，2：COMT

图1植物表达载体pBSP-antiCOMT-2301图2COMT基因全长的扩增

Fig.1Plant expressing vector pBSP-antiCOMT-2301Fig.2The amplification of full length COMT

2.2农杆菌介导的遗传转化及亚麻植株再生

2.2.1亚麻品种黑亚14号再生体系的优化

研究对亚麻品种黑亚14进行再生条件的优化研究。黑亚14的最适的种子消毒条件为70%乙醇1.0 min，10%次氯酸钠20 min。最适愈伤组织诱导分化培养基为MS培养基+0.05 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8。最适不定芽伸长培养基为MS培养基+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8。

2.2.2农杆菌共培养转化亚麻

农杆菌转化后的下胚轴转入含头孢曲松钠(500 mg/L)和卡那霉素(100 mg/L)MS 固体培养基中，1周后，对照组下胚轴逐渐褐化死亡(图3)。转基因亚麻下胚轴培养3周后，分化出不定芽(图4)。

左：CK(非转基因植株)，

右：转pBSP-antiCOMT-2301植株

图3CK及转基因植株图4Kna筛选的转pBSP-antiCOMT-2301植株

Fig.3CK and transgenic plantFig.4pBSP-antiCOMT-2301 plant of Kna screening

2.3转基因亚麻的 PCR 检测

选取转基因植株，分离其叶片基因组DNA，以COMT特异性引物进行扩增，获得了预期大小(1.1 kb)的DNA，证明COMT基因已经整合入亚麻基因组中(图5)。

1-14，pBSP-antiCOMT-2301转化植株的1-14号株系；15，pBSP-antiCOMT-2301对照；16，非转基因植株。

3讨论

大部分关于木质素合成生物调控的遗传操作都选用组成型强启动子CaMV35S，它能启动所转入的基因在所有植物组织中进行非特异性表达，这可能对植物的正常生长及抗逆性造成负面影响，要避免这个问题可以使用组织特异性启动子(如本研究的杨树皮储藏蛋白启动子)，另外，由于木质素合成酶基因中大部分存在多基因家族现象，故在制备RNAI载体时，应该选择与其他家族基因序列同源性低的序列。

亚麻组织培养过程中易发生徒长现象，分析原因是温度较高、光照时间长导致，组培苗应放在温度不高于25℃，光照时间不长于自然光照即可避免徒长现象。

本研究通过pBSP-antiCOMT-2301的转化，为利用基因工程技术抑制亚麻木质素生物合成，创造适合中国国情的环保型低木质素亚麻转基因新品种奠定了基础。

参考文献：

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Transformation and Detection ofLinumusitatissimumwith COMT Gene

HUANG Wengong1,2，KANG Qinghua2，JIANG Weidong2，YAO Yubo2，ZHAN Yaguang1*

(1.Northeast Forestry University, Harbin 150040,China;2.Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086,China)

Abstract：The COMT gene mainly participates in the biosynthesis of S lignin. The content of lignin will reduce when the activity of COMT gene is suppressed in the transgenic plants. In this study，the BSP and COMT were inserted into the vector pCAM2301 to construct a recombinant expression gene. The recombinant gene was transformed into fiber flax by Agrobacterium tumefacien mediated callus transformation. The transformed calluses were subjected to kanamycin screening and resistance callus was induced in induction and differentiation culture. The transformed seedlings were obtained and verified by PCR. The COMT gene was integrated into genome of the flax. We gained the positive genetic flax would lay a solid foundation for the research of flax fiber and variety breeding.

Key words：flax；COMT；transformation

中图分类号：S563.2

文献标识码：A

作者简介：黄文功(1980-)，男，在读博士研究生，助理研究员，主要从事亚麻育种研究。E-mail:huangwengong1736@163.com。*通讯作者：詹亚光(1963-)，女，研究员，主要研究方向为植物基因工程和植物细胞工程及其利用。E-mail: yaguangzhan@126.com。

基金项目：现代农业产业技术体系(CARS-19)

收稿日期：2016-01-01

文章编号：1671-3532(2016)02-0054-04