原花青素对血管性认知功能障碍大鼠脑单胺类神经递质含量的影响

苏军红， 徐晓臣， 王英杰， 赵冉冉

(1邯郸市第一医院神经内科，邯郸　056002； 2邯郸市第一医院急诊科； *通讯作者，E-mail:15830404276@163.com)



原花青素对血管性认知功能障碍大鼠脑单胺类神经递质含量的影响

苏军红1， 徐晓臣1， 王英杰1， 赵冉冉2*

(1邯郸市第一医院神经内科，邯郸056002；2邯郸市第一医院急诊科；*通讯作者，E-mail:15830404276@163.com)

摘要：目的观察原花青素(proanthocyanidins，PAC)对血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)大鼠认知功能和脑内单胺类神经递质和单胺氧化酶含量的影响。方法选取健康成年雄性Wistar大鼠48只，随机分为4组：假手术组(sham)、血管性认知功能障碍组(VCI)、低剂量原花青素组(L-PAC,100 mg/kg)和高剂量原花青素组(H-PAC,200 mg/kg)。双侧颈动脉结扎术制备血管性认知功能障碍模型，造模后每天灌胃给药，给药容量为2 ml，共给予28 d。Morris水迷宫检测VCI大鼠认知功能，水迷宫结束后取材，采用分光光度计检测前脑皮层单胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)的含量，高效液相色谱仪法检测大鼠前脑皮层去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)的含量。结果与sham组相比较，VCI组大鼠前脑皮层中5-HT、NE和DA的含量均显著下降(P<0.05)，MAO含量明显升高(P<0.05)；与VCI组相比较，低剂量和高剂量PAC治疗明显增加VCI大鼠前脑皮层中NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，减少MAO的含量(P<0.05)。结论原花青素能够明显提高VCI大鼠的空间学习记忆能力，能够调节VCI大鼠脑内单胺类神经递质系统。

关键词：血管性认知功能障碍；原花青素；单胺类神经递质

血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)由心、脑血管病引起，表现为认知功能的下降，严重时表现为血管性痴呆。随着人口老龄化的到来，心脑血管病的发病率呈不断上升趋势，医疗水平的提高使心脑血管疾病的生存率不断升高，因此VCI病人数量迅速增长，带来了沉重的医疗负担。目前临床中尚缺乏能够改善VCI认知水平的特效药物。目前研究认为，氧化应激参与了血管性认知功能障碍的发病过程，抗氧化剂通过减轻机体氧化应激水平，具有改善血管性认知功能障碍的作用。原花青素是优良的自由基清除剂，在体内具有强效抗氧化功能。既往已有研究发现，原花青素能够改善阿尔兹海默模型大鼠的学习记忆功能，并显著提高大鼠脑内抗氧化酶的活性[1]。本研究通过双侧颈总动脉结扎制备血管性认知功能障碍大鼠模型，观察原花青素对血管性认知功能障碍大鼠前脑皮层中单胺类神经递质、单胺氧化酶含量的影响及对认知功能的保护作用。

1材料与方法

1.1药品和主要试剂

原花青素(proanthocyanidins,PAC)由Sigma公司提供，去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)标准品均由中国生物药品制品检定所提供，单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物分组和模型制备

健康雄性Wistar大鼠48只，体重250-290 g，河北医科大学实验动物中心提供，随机数字表法分为4组：假手术组(sham)、血管性认知功能障碍组(VCI)、低剂量原花青素组(L-PAC)和高剂量原花青素组(H-PAC)，每组12只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物后，仰卧位固定，颈前区去毛并消毒，颈前正中纵行切开皮肤及皮下组织，钝性分离出双侧颈总动脉，套以丝线结扎近心端和远心端，从两个结扎点间剪断动脉后缝合皮肤，放回笼中，严密观察大鼠一般情况。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不阻断血流。sham组和VCI组每日灌胃2 ml生理盐水，L-PAC组和H-PAC组给予100 mg/kg和200 mg/kg PAC灌胃相应剂量，每日1次，共28 d。

1.3Morris水迷宫试验

于实验第29天起行Morris水迷宫试验，第29-33天为定位航行试验，每日大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序分别从4个入水点放入水中，记录120 s内大鼠爬上平台花费时间为逃避潜伏期，第34天为空间探索试验，将平台撤去，记录大鼠2 min内停留在平台所在象限的时间。

1.4高效液相色谱仪分析NE、DA、5-HT含量

Morris水迷宫试验结束后，大鼠以7%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后，断头取脑，冰盘上快速分离前脑皮层组织，称湿重，按1∶10(mg ∶μl)加入预冷的高氯酸，在冰浴中制备成10%匀浆，离心后取上清液，采用高效液相色谱仪分析各指标含量。

1.5MAO检测

Morris水迷宫试验结束后大鼠断头取脑，冰盘上快速分离前脑皮层组织，称湿重后加冰生理盐水制备成10%匀浆，按照试剂盒说明书进行具体实验步骤。

1.6统计学分析

应用SPSS13.0进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差表示，逃避潜伏期数据应用重复测量设计的方差分析，其余数据均应用one-way ANOVA进行统计分析，两两比较采用SNK检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1水迷宫实验结果

与sham组相比较，VCI组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，目标象限停留时间明显缩短(P<0.05)；L-PAC组和H-PAC组分别与VCI组相比逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05)，目标象限停留时间明显延长(P<0.05，见表1)。各组大鼠游泳速度无差异。

表1原花青素对Morris水迷宫成绩的影响(s)

Table 1The effects of PAC on Morris water maze performance(s)

组别 逃避潜伏期Day29Day30Day31Day32Day33目标象限停留时间sham组58.21±10.2150.45±10.2831.10±9.5120.48±9.4311.37±3.6327.07±5.12VCI组66.34±13.1254.67±12.4142.71±10.59*39.52±11.70*26.46±8.41*9.39±4.81*L-PAC组59.54±11.4552.46±10.3640.61±10.84#28.34±10.47#15.31±6.01#14.93±5.21#H-PAC组61.21±13.4349.89±10.4835.18±8.2926.71±7.5913.05±2.8222.65±6.84

与sham组比较，*P<0.05；与VCI组比较，#P<0.05

2.2原花青素对前脑皮层单胺类神经递质和MAO含量的影响

与sham组相比，VCI组大鼠前脑皮层内NE、DA和5-HT的水平明显降低(P<0.05)，MAO的含量显著升高(P<0.05)；低剂量原花青素组和高剂量原花青素组均能明显缓解血管性认知功能障碍大鼠脑内单胺类神经递质的紊乱，明显升高NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，并能使MAO的含量显著升高(P<0.05)；低剂量原花青素组NE、DA、5-HT和MAO仍未达到对照组的正常水平，高剂量原花青素组各项指标水平与sham组相比无显著差异(见表2)。

3讨论

血管性认知功能障碍可由高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、吸烟等影响脑血流量等多种因素诱发[2]。VCI患者的主要临床表现是学习和记忆功能的下降。由于VCI发病人数的上升，VCI已经成为神经科学研究的前沿和热点。近年来的研究表明，VCI的发病机制可能是由于氧化应激、神经递质紊乱、促炎因子的释放等多重因素导致神经元和白质的损害所致[3-5]。动物实验发现，双侧颈总动脉结扎术后大鼠脑内脂质过氧化和氧化性DNA损伤均明显增加[6,7]。抗氧化有可能是血管性认知功能障碍的有效治疗靶点[8]。

表2原花青素对前脑皮层NE、DA、5-HT和MAO含量的影响

Table 2Effects of PAC on levels of NE, DA, 5-HT and MAO in the forebrain cortex

组别 NE(ng/g)DA(ng/g)5-HT(ng/g)MAO[U/(h·mg)]Sham组312.11±19.53411.94±38.25433.17±31.5320.83±2.41VCI组183.27±10.81*253.51±18.90*218.51±14.66*38.21±3.73*L-PAC组 268.32±18.51*# 314.10±30.33*# 387.27±34.13*# 29.12±1.78*#H-PAC组299.80±19.56#420.20±31.28#420.33±31.48#18.38±1.39#

与sham组相比较，*P<0.05；与VCI组相比较，#P<0.05

目前研究认为[9-12]，神经递质与学习记忆功能密切相关，胆碱能神经递质系统的状态与认知密切相关，中枢神经系统单胺类神经递质在学习、记忆过程中发挥了易化作用。5-HT是重要的单胺类神经递质，与睡眠、情感、学习、记忆功能密切相关。单胺类神经递质的合成、释放是学习、记忆功能正常的基础。脑内单胺类神经递质含量的下降是认知功能受损的典型特点[10]。此外，有研究发现，5-HT再摄取抑制剂药物能有效改善动物在Morris水迷宫中的表现，表明调节中枢神经系统单胺类神经递质含量具有改善认知功能的作用[11]。

原花青素(PAC)是天然存在的多酚类化合物，广泛存在于植物中，尤以葡萄籽中含量最高。PAC具有极强的抗氧化能力，也可清除体内的活性氧自由基，其抗氧化能力是维生素的50倍。大量研究表明，PAC通过抗氧化能力具有神经保护和抗衰老作用。既往研究证实，原花青素能够改善阿尔茨海默和血管性痴呆大鼠的认知功能[13]，但其具体机制还未明确。

本研究表明，通过双侧颈总动脉结扎术后，大鼠学习、记忆能力明显下降，血管性认知功能障碍模型建立成功，原花青素干预4周后大鼠认知功能得到明显的改善，且改善作用与剂量相关；进一步检测大鼠皮前脑层中单胺类神经递质含量发现，VCI大鼠DA、NE和5-HT的含量均有明显下降，MAO含量显著升高，而原花青素干预4周后可减轻改善单胺类神经递质失衡。证实PAC具有保护VCI大鼠学习、记忆功能的作用，同时PAC能够调节前脑皮层中单胺类神经递质含量。然而，PAC究竟是通过何种机制调节了单胺类神经递质的含量，还有待进一步研究。

总的来说，原花青素在血管性认知功能障碍大鼠模型中，具有保护认知功能的作用，而且能够调节前脑皮层中单胺类神经递质含量。本研究为血管性认知功能的临床治疗提供了理论依据。原花青素有可能成为治疗血管性认知功能障碍的有效药物，还需进一步的研究以验证其治疗作用。

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Effects of proanthocyanidins on monoamine transmitters in vascular cognitive impairment rats

SU Junhong1, XU Xiaochen1, WANG Yingjie1, ZHAO Ranran2*

(1DepartmentofNeurology,FirstHospitalofHandan,Handan056002，China;2DepartmentofEmergency,FirstHospitalofHandan;*Correspondingauthor,E-mail:15830404276@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of proanthocyanidins(PAC) on the contents of monoamine neurotransmitters and monoamine oxidase(MAO) in vascular cognitive impairment rats.MethodsForty-eight healthy adult male Wistar rats were randomly assigned into four groups: sham group, VCI group, low-dose PAC group and high-dose PAC group. Bilateral common carotid arteries were occluded in healthy adult male Wistar rats to establish VCI model. Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function. MAO was measured spectrophotometrically, and the levels of norepinephrine(NE), doparmine(DA) and 5-HT in the forebrain cortex were detected by HPLC.ResultsCompared to sham group, the contents of NE, DA and 5-HT significantly decreased in VCI group(P<0.05), while MAO significantly increased(P<0.05). Compared with VCI group, NE, DA and 5-HT significantly increased in both low-dose PAC group and high-dose PAC group(P<0.05), while MAO decreased(P<0.05).ConclusionPAC could significantly improve spacial learning and memory abilities, and restore central monoamine neurotransmitters system.

Key words:vascular cognitive impariment;proanthocyanidins;monoamine transmitter

[收稿日期：2015-10-24]

作者简介：苏军红，女，1971-12生，本科，副主任医师.

中图分类号：R742

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)02-0124-03

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.005

基金项目：邯郸市科学技术研究与发展计划资助项目(1523108138)