病毒性心肌炎患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ细胞因子水平的分析

陈　锐，陈艳清，贾　建，许　瑶，张达秀，李婉葵，邵锦欢

(东莞市塘厦医院检验科，广东东莞 523721)



·临床研究·

病毒性心肌炎患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ细胞因子水平的分析

陈锐，陈艳清，贾建，许瑶，张达秀，李婉葵，邵锦欢

(东莞市塘厦医院检验科，广东东莞 523721)

摘要:目的研究病毒性心肌炎患者外周血中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的水平，分析上述指标与心肌炎的相关性。方法选取2013年1月至2015年1月间入院就诊的病毒性心肌炎患者32例，作为实验组。选取同期入院体检的健康人32例作为对照组。应用ELISA方法检测血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平。32例病毒性心肌炎患者应用常规抗病毒、镇静治疗后，应用实时荧光定量PCR法检测TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平，观察并比较治疗前后3项指标的变化。结果病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢复期稍有下降，当仍显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明显较高(P<0.05)。结论血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平变化在病毒性心肌炎发病中有重要作用，可在临床作为病情判断及疗效评价的参考指标。

关键词:病毒性心肌炎；肿瘤坏死因子-α；转化生长因子-β1；细胞因子干扰素-γ

病毒性心肌炎(viral myocardtis，VMC)指病毒感染心肌细胞，导致细胞溶解引起心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，结果造成病毒对心肌细胞直接损伤和继发免疫反应对心肌组织的持续损害[1]。目前临床尚未能确认VMC确切的发病机制，但机体免疫功能紊乱和炎性细胞因子在其发病中的作用不容小觑。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过结合相应受体从而具有调节细胞生长、分化、调节免疫应答的作用。本研究就VMC患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ 细胞因子的水平进行了分析，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料选取2013年1月至2015年1月间入院就诊的病毒性心肌炎患者32例，作为实验组。所有患者均符合成年人急性病毒性心肌炎的诊断参考标准[2-3]。选取同期入院体检的健康人32例作为对照组。排除标准：先天性心脏病、心肌病等心脏疾病；1个月内无感染、腹泻病史；智力及精神异常，无法配合此次研究者。实验组32例患者中，男19例、女13例；年龄30～65岁，平均(46.25±12.03)岁；发病前1～3周均有上呼吸道感染史。对照组32例中男18例、女14例；年龄32～61岁，平均(46.32±11.91)岁。两组在年龄、性别等基础资料方面无统计学差异，可参与比较。

1.2方法

1.2.1标本采集所有受试者在清晨空腹抽取静脉血3 mL，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，分装-20 ℃留存备用。

1.2.2标本的检测应用ELISA检测两组患者血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白含量，试剂盒购自bd biosciences pharmingen公司。操作步骤如下，(1)标准曲线：冻干标准品复溶，静置15 min，倍比梯度稀释(标准曲线取7个点，最高浓度为1 000 pg/mL,标准品稀释液直接加入作为0浓度)。(2)取标本血清及标准品100 μL加入相应孔中，封板，室温孵育2 h，洗板5次，拍干。加生物素化抗体100 μL到每孔，封板，室温孵育1 h，洗5次，拍干。加酶结合物100 μL，封板，暗室室温孵育20 min，洗5次，拍干。加显色剂100 μL，暗室室温孵育20 min，加终止液100 μL终止反应。(3)酶标仪检测，读其A450值，绘制标准曲线，算出标本浓度。并在32例病毒性心肌炎患者应用常规抗病毒、镇静治疗后，另行蛋白水平检测。设定实验组治疗前为VMC急性期，治疗后为VMC恢复期。

同时应用实时荧光定量PCR法，见表1，检测两组患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平。检测试剂盒、引物和探针序列均由上海基康生物技术有限公司提供，检测仪器使用罗氏 Lighteyeler 荧光定量PCR 仪。

2结果

2.1TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢复期稍有下降，但仍显著高于正常对照组(P<0.05)。见表2。

2.2TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平与对照组相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1　　实时荧光定量法检测TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平

表2　　两组患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平

#:与对照组相比，P<0.05；*:与VMC急性期相比，P<0.05。

表3　　两组患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ

3讨论

目前对VMC发病机制抑制存在诸多争议，以免疫学说与细胞因子论支持者较多[4]。VMC是由多种病毒引起的以心肌间质炎症为主的疾病，柯萨奇B组病毒是主要病原。病毒通过消化道或呼吸道侵入人体发生病毒血症，侵犯心肌。感染初期机体首先发动细胞免疫反应，增强机体对病毒免疫力，同时单核巨噬细胞趋化，产生及分泌细胞因子[5]，进而调控疾病进展。

TNF-α是一种具有多种生物学活性的细胞因子，可增强中性粒细胞吞噬能力、促进细胞增殖与分化并具有抗感染作用，其既参与机体免疫系统，也是机体炎性反应及损伤的重要调节因子[6]。TNF-α来源广泛，主要由巨噬细胞和活化的单核细胞产生，心脏既是TNF-α的合成场所又是其作用的靶器官。在本次研究中，TNF-α在VMC急性期表达高达(128.31±12.48)ng/L，且TNF-α mRNA水平也显著高于对照组，提示TNF-α参与了病毒性心肌炎的发展过程。

TGF-β1是胶原纤维细胞外基质合成和沉积的强有力的始动因子，也是诸多因素导致心肌纤维化最后的共同的中介物之一，研究认为TGF-β1阳性表达是反映心肌炎症性损伤修复的灵敏指标[7]。本次研究中，VMC急性期患者TGF-β1蛋白水平为(15.18±1.42)ng/mL，VMC恢复期则为(9.53±1.41)ng/mL，正常对照组仅为(6.27±0.83)ng/mL。汪东华等研究中[8]，TGF-β1在明确心肌炎患者中的表达水平高达(32.97±4.88)ng/mL，界限性心肌炎组则为(15.17±1.62)ng/mL，正常对照组TGF-β1水平仅为(6.62±0.98)ng/mL。提示TGF-β1在健康人中水平较低，而病毒性心肌炎病情越重则TGF-β1水平越高。同时本次研究中TGF-β1水平整体偏低可能与VMC患者病情程度有关。

IFN-γ是由活化的T细胞产生的，具有抗病毒的作用，同时通过参与诱导主要组织相容性复合体II类抗原的表达而发挥一定的免疫调节作用[9]。IFN-γ表达过高会引起自身细胞的损伤，并可通过影响细胞表面特定受体而产生负性肌力作用[10]。同时IFN-γ可抑制病毒复制，过低水平的IFN-γ不利于清除病毒。在本次研究中，VMC恢复期IFN-γ水平介于较高的VMC急性期及较低的对照组之间，证实了上述理论。

综上所述，血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平变化在病毒性心肌炎发病中有重要作用，可在临床作为病情判断及疗效评价的参考指标。

参考文献

[1]张艳，石搏，王元春，等.病毒性心肌炎患儿外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ细胞因子水平分析[J].中国妇幼保健,2013,28(5):789-790.

[2]中华内科杂志编委会.全国心肌炎心脏病专题座谈会纪要[J]．中华内科杂志，1987，26(35)：597-601．

[3]全国心肌炎.心肌病专题研讨会组委会.全国心肌炎、心肌病专题研讨会纪要[J]．临床心血管病杂志，1995，11(6)：324-326．

[4]Adamopoulos S,Kolokathis F,Gkouziouta A,et al.Cytokine gene polymorphisms are associated with markers of disease severity and prognosis in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Cytokine,2011,54(1):68-73.

[5]张小佛，于小华，郭富强，等．病毒性心肌炎患儿血清巨噬细胞移动抑制因子、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β表达及其意义[J]．实用儿科临床杂志，2008，23(1)：35-36．

[6]李友邕，周碧燕，覃李线，等．病毒性心肌炎患儿血清中TNF-α、hs-CRP、cTnI检测的临床意义[J]．临床和实验医学杂志，2013，12(17)：1368-1369．

[7]马文东，袁媛，杨奕，等.TGF-β1介导的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纤维细胞分化中的调节作用[J]．中国病理生理杂志,2013,29(10):1758-1763.

[8]江东华，罗斌，孔小平，等．病毒性心肌炎猝死心肌MMP-9和TGF-β1表达与心肌纤维化的关系[J]．中国法医学杂志，2008，23(3)：163-166．

[9]李艳花,张海飞,张鑫辰,等.INF-γ在可溶性β-淀粉样蛋白(fAβ)介导的小胶质细胞神经毒性中的增敏作用[J]．复旦学报：医学版,2013,40(3):259-264.

[10]Balci SO,Col-Araz N,Baspinar O,et al.Cytokine gene polymorphisms in childhood dilated cardiomyopathy:interferon-gamma,tumor necrosis factor-alpha and transforming growth factor-beta 1 genes are associated with the disease in Turkish patients[J].Iran J Pediatr,2013,23(5):603-604.

(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.045

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)08-1119-02