临床副溶血弧菌血清型及基因分型特征研究

印晓静，徐　薇，韩东升

(江苏省苏北人民医院医学院医学检验科，江苏扬州 225001)



·论著·

临床副溶血弧菌血清型及基因分型特征研究

印晓静，徐薇△，韩东升

(江苏省苏北人民医院医学院医学检验科，江苏扬州 225001)

摘要:目的了解本地区腹泻患者中副溶血弧菌(VP) 血清型及分子分型特征，为VP感染的防控提供科学参考。方法对2010～2014年收集到的62菌株进行血清型分型；采用PCR检测溶血素相关毒力基因(tdh和trh)；利用多位点序列分型(MLST)进行分子分型。 结果62株菌株分属7种不同的血清型，O3∶K6型居首，共46株，占74.19%，其次是O4∶K68(6株)。毒力相关基因检测发现tdh阳性株占95.16% (59株)，而trh阳性者仅3株。分子分型确定7种STs，其中ST3型占85.50% (53株)，其他ST型散在分布。结论O3∶K6血清型VP是本地区最主要的分离株，大多携带tdh毒力基因，ST3型是优势流行型别。

关键词:副溶血弧菌；毒力基因；血清型；基因分型

副溶血弧菌(VP) 是一种在世界沿海国家和地区流行较为广泛的一种食源性致病菌，主要导致人类的急性腹泻。VP感染威胁着公众健康并为患者带来了经济负担。据统计，在美国，每年平均有34 664(18 260～58 027)例VP感染事件，病死率约0.9%[1]。在日本、中国台湾和越南等地，大约一半的食源性暴发事件由VP引起[2-3]。我国的食源性疾病监测网数据显示，VP感染暴发事件居微生物食源性疾病爆发的首位[4]。本研究收集了临床腹泻患者的粪便标本，开展VP的血清型及基因分型特征研究，通过血清分型、毒力基因检测及多位点序列分型(MLST)，探讨临床VP的流行特点，为防控VP感染提供参考依据。

1资料与方法

1.1菌株来源标本来源于本地区2010～2014年的急性腹泻患者，纳入标准：每日排便不少于3次，且大便性状有改变(呈稀便、水样便、黏液/脓液便或脓血便等)，病程不超过14 d。

1.2方法

1.2.1菌株的分离及鉴定标本采集后直接接种于碱性蛋白胨水进行增菌，VP的分离培养与鉴定按《全国临床检验操作规程》[5]进行。采用法国生物梅里埃公司产品VITEK2 Compact 微生物鉴定仪进行细菌鉴定。

1.2.2血清分型购买日本生研株式会社生产的VPO、K抗原分型诊断血清，用玻片凝集法进行O、K血清型鉴定，具体操作步骤严格按照操作说明书。

1.2.3毒力基因检测将分离鉴定的VP菌株，纯培养后制备成菌悬液，煮沸法提取菌株DNA模板,毒力基因tdh和trh的引物序列及反应条件参考以往报道[6]。

1.2.4MLST62株临床来源的VP进行MLST分析。实验方法参照pubMLST数据库(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)提供的标准进行：对VP的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和tnaA进行PCR扩增，产物测序结果与pubMLST数据库进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型(ST)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2结果

2.1血清型分布62株VP分为7种不同的血清型，以O3∶K6为主，有46株，占74.19%，其次是O4∶K68(6株)，O1∶K56(3株)和OUT∶KUT(3株)；2株为O4∶KUT；O1∶KUT和O3∶KUT各1株，见表1。OUT指O血清型未能鉴定；KUT指K血清型未能鉴定。

2.2毒力相关基因分布 对62株VP进行tdh和trh毒力基因扩增59株(95.16%)分离菌携带tdh基因，而trh阳性株仅3株。具体组合基因型表现为：tdh(+)trh(-)菌株56株，tdh(+)trh(+)菌株3株,tdh(-)trh(-)菌株3株。见表1。

表1　　62株VP血清型及毒力相关基因分布情况(n)

2.3MLST62株VP分属于7种STs，其中ST3共53株，占85.50%，ST8 3株，ST120 2株，其他4种ST型(ST69、ST527、ST332和ST417) 各1株。见表2。

表2　　62株VP MLST分析(n)

3讨论

VP是我国东南沿海地区一个重要的食源性致病菌[7]。目前，VP共有约75种血清型与人类腹泻有关。1996年2月以来，一种新的具有特种基因型别的O3∶K6血清型菌株在亚洲、美洲、非洲和欧洲的国家和地区发生大规模的洲际流行[8]。在我国，O3∶K6型菌株也是最主要的血清克隆群[7]。本研究共发现7种血清型，其中O3∶K6型是最重要的血清型，占74.19%；其次是O4∶K68 (6株) 和O1∶K56 (3株)，和世界许多国家流行的血清型基本一致。本研究中3株菌(OUT:KUT)未能鉴定出O和(或)K血清型，可能与菌株本身在宿主体内容易发生血清抗原转变有关，这些菌株需要进一步的研究来明确其基因分型特征。

tdh被认为是VP的最主要的毒力因子，本研究中分离到的绝大多数VP菌株表现为tdh阳性和trh阴性，只有3株同时携带tdh和trh基因，这说明了tdh是本地区VP最主要的致病因子。同时，还发现3株菌均未携带tdh和trh基因，这种现象在其他研究结果中也有报道[9]，所以推测，VP致病性除了与tdh和trh有关外，这些表现为两者均阴性的菌株还可能存在的其他独立致病因子。但是，不能排除患者的体内同时存在的其他致病性微生物的混合感染，而这些其他微生物才是真正致病的元凶，在被检出的情况下，这些本不致病的VP菌株误被当成了致病菌。所以，临床标本中检测到的tdh阴性和trh阴性的菌株到底是不是真正的致病菌以及其的致病性强度还有待进一步分析。

随着分子生物学检测技术的发展，多种细菌分型技术如血清学分型、噬菌体分型及脉冲场凝胶电泳(PFGE)等被广泛应用于副溶血性弧菌的分型研究，在VP的疾病预防和暴发的防控中起着非常重要的作用。MLST是一种较新的分子分型方法，以细菌基因组中管家基因的序列分析为基础，具有较高的分辨率和识别度，能更好地理解菌株间的遗传亲缘关系以及基因水平转移对细菌进化的重要性。本研究对62株VP进行了MLST分析，共分出7种STs，其中ST3共53株，占85.50%，是优势型别，但同时又存在着多种亚型。

综上所述，本研究通过开展本地区急性腹泻人群中VP的研究，获得了VP血清型构成情况；同时通过开展毒力相关基因检测及MLST分子分型研究，为VP的致病机制及分子流行病学研究提供了科学数据支持，为更好地做到VP感染性腹泻的防控和预警提供了重要的参考依据。

参考文献

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Serotyping and genotyping study of clinical Vibrio parahaemolyticus*

YinXiaojing,XuWei△,HanDongsheng

(DepartmentofLaboratoryMedicine,NorthernJiangsuPeople′sHosptial，Yangzhou,Jiangsu225001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the distribution and molecular characteristics of Vibrio parahaemolyticus(VP) in patients with acute diarrhea,and provide a scientific basis for the prevention and control of VP infection.MethodsFrom 2010 to 2014，62 VP isolates were collected from patients with acute diarrhea,for serotyping and virulence gene (tdh and tdh) detection of VP.Molecular characteristics analysis was carried out by using multi-locus sequence typing (MLST).Results7 different serotypes were found from the 62 isolates.O3∶K6 was the most common serotype of VP,accounting for 74.19% (46 isolates),followed by O4∶K68 (6 isolates).Tdh gene was the mainly virulence gene,with a percentage of 95.16% (59 isolates),only three isolates were trh positive.7 STs were found through MLST analysis of 62 VP isolates,among which,ST3 was the most important type,accounted for 85.50% (53 isolates).ConclusionO3∶K6 serotype VP was the most prevalent type.Tdh gene is the most important virulence gene of WP.ST3 was the the dominant epidemic type.

Key words:vibrio parahaemolyticus;serotyping;virulence;genotyping

(收稿日期：2016-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.005

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)08-1028-02

作者简介：印晓静，女，主管检验技师，主要从事临床检验方面的研究。△通讯作者，E-mail:842371507@qq.com。