蒙药梅花草乙醇提取物对肝癌细胞增殖作用的实验研究△

红 艳 达拉胡 辛 颖

(内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

蒙药梅花草乙醇提取物对肝癌细胞增殖作用的实验研究△

红 艳 达拉胡 辛 颖*

(内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

目的：研究蒙药梅花草的乙醇提取物对人肝癌细胞(HepG2细胞)的体外增殖抑制作用。方法:采用MTT法检测梅花草乙醇提取物的不同剂量组对HepG2细胞增殖的抑制作用；ELISA检测HepG2细胞内Bax和Bcl-2蛋白的表达变化情况。结果:梅花草乙醇提取物处理HepG2细胞24h后，可以明显抑制HepG2细胞的增殖。与对照组相比，梅花草的乙醇提取物可以明显升高HepG2细胞的Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05和P<0.05)。结论:蒙药梅花草的乙醇提取物体外对HepG2细胞的增殖有抑制作用，其作用机制与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

梅花草乙醇提取物；HepG2细胞；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

梅花草(Parnassis palustris L.)为虎耳草科梅花草属植物突隔梅花草的全草或根，又称白侧草、马蹄草等，是蒙古族历代和民间常用的特色蒙药，蒙古名为那木戛纳、乌力地格和那木日因查干-其其格等。在现代蒙医临床应用是用于治疗肿瘤及其相关疾病的常用蒙药材之一。梅花草气味甘、苦，无明显毒性，具有清热解毒、破痞、消肿排脓和抑希日等功效，临床主要用于治疗腑器热性希日病和热性痞症，即治疗肝、胆肿瘤及部分肠道肿瘤(如结肠肿瘤)等，也可以治疗黄疸型肝炎、咽喉炎、腮腺炎、脉管炎和肺结核等[1，2]。

“破痞”属于一种蒙药功效，相当于现代医学中的抗肿瘤作用。现代蒙药药理学[3]上认为具破痞功效的蒙药具有抗肿瘤活性。蒙医理论认为“痞症”可发生于人体的各个器官，多属于继发于各种疾病的郁结性痼疾，其发病原因主要是由于维持人体生命的“三根”(赫依、希日、巴达干)因某种原因失去平衡，使“七素”(食物精华、血、肉、脂、骨、骨髓、精液)的转化过程中因积聚凝结而成浑浊、恶血激增、黄水淤积，在赫依的促动作用下，在人体的某一部位形成痞块。医治痞病，不但要破痞瘤本身同时要判明其发病原因，对症施治。长期以来，蒙医药学对于“痞症”的治疗方面已经积累了非常丰富的治疗方法和传统用药经验，临床疗效显著，并且副作用小，资源丰富。但存在的挑战在于如何利用现代医药学理念去解释蒙医药“破痞”功效的根本原因和机制。

据文献查阅，目前未见国内外专家和学者关于蒙药梅花草的“破痞”功效的活性化学成分和作用机制等方面的研究报道。从天然药物的发展趋势来看，应该将化学成分和药效学研究结合起来进行研究，应该以天然药物的有效部位为切入点，对其有效部位进行提取分离，了解其主要活性成分，再进一步寻找其作用机制。本研究沿着天然药物研究的这一思路，首先拟用活性追踪法对蒙药梅花草乙醇提取物的抗肿瘤作用进行研究，旨在通过体外实验初步评价梅花草的乙醇提取物对人肝癌细胞(HepG2细胞)的增殖是否具有抑制作用，进一步研究梅花草的抗肿瘤效果。

1 实验材料

1.1 细胞：人肝癌细胞系(HepG2细胞)购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 仪器：TS100倒置相差显微镜(日本尼康)；SW-CJ-2F双人双面净化工作台(苏州智净有限公司)；DNM-9602酶标(北京普朗责任有限公司)；3110系列水套CO2培养箱(美国Thermo Scientific)；GYJ1/2-40L-S超纯水机(重庆华创责任有限公司)；YXQ-LS-100A立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯有限公司)；DHG-9203A鼓风干燥箱(上海精宏有限公司)；98-1B型电子调温电热套(天津市秦斯特仪器有限公司)；KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(德国Heidolph集团)；SHZ-DIII循环水式多用真空泵(郑州长城仪器有限公司)；96孔培养板及培养瓶(美国Corning公司)。

1.3 试剂：DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；MTT(北京索莱宝科技有限公司)；胰酶(北京索莱宝科技有限公司)；人B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；人Bcl-2相关X蛋白(Bax)ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；生理盐水、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等试剂均购自天津科密欧公司。

2 实验方法

2.1 药物制备：取一定量的梅花草(500g)，用95%的乙醇浸泡后放于大圆底烧瓶中加热浸煮，每次煮3h，提取3次，每次所得的煮液合并为提取液，减压浓缩干燥后得浸膏，备用。经计算得提取率为33.26%。用DMSO作为梅花草乙醇提取物的溶剂。

2.2 MTT实验：HepG2细胞消化，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，培养24h，加入不同浓度的梅花草乙醇提取物，使终浓度为3.125、4.167、6.25、12.5mg/mL，置CO2培养箱内孵育24h，弃培养液，每孔加MTT溶液(5mg/mL)50μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内MTT，每孔加100μLDMSO，振荡2～3min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔OD值，记录结果，计算抑制率。抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，实验重复3次，取平均值。

2.3 ELISA检测Bax、Bcl-2蛋白表达：HepG2细胞加入梅花草的乙醇提取物处理24h后，用PBS洗涤2次，用ELISA方法测定细胞上清液中Bax和Bcl-2蛋白的含量。使用标准曲线法，按着试剂盒的说明方法进行操作，使用酶标仪检测结果。

2.4 统计学方法：应用SPSS17.0软件进行统计学分析，所有数据用平均值±标准差表示，多组间均数差异性比较采用单因素方差分析，P<0.05或P<0.01为差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 梅花草乙醇提取物对HepG2细胞的生长抑制作用：梅花草乙醇提取物在浓度为4.167、6.25、12.5mg/mL时对HepG2细胞均表现出抑制其增殖的作用，且随着提取物浓度的增高而抑制作用逐渐增强。结果见表1。

表1 梅花草乙醇提取物对HepG2细胞增殖的作用

注：与对照组相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01

3.2 梅花草乙醇提取物对HepG2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：与对照组相比，梅花草乙醇提取物浓度为12.5mg/mL 时Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05和P<0.05)。梅花草乙醇提取物的其他浓度与对照组比较差异不显著(P>0.05)。结果见表2。

表2 梅花草乙醇提取物对HepG2细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

注：与对照组相比，＊P<0.05

4 讨论

中蒙药既可以作为抗肿瘤的手术治疗、放射性治疗和化学药物治疗的辅助用药，又可以独立发挥直接的抗肿瘤作用。它防治肿瘤的作用机理一般是比较复杂的，常常涉及到多个靶点、多条途径和多种环节的共同作用，包括抑制肿瘤自身血管的生长、调节机体自体免疫的功能、诱导促进肿瘤细胞的凋亡和分化、调节肿瘤细胞的信号传导通路、逆转肿瘤细胞的多重耐药性和抑制端粒酶活性等[4]。此外，与化学合成药物相比，中、蒙药还具备很多实用性的特点利于其应用，比如其取材方便、价格低廉、毒副作用小等。所以中、蒙药及其有效成分的抗肿瘤作用及其机理的研究已成为当今医药学领域研究的重点。

本实验研究的结果显示，梅花草乙醇提取物的不同剂量组对HepG2细胞可以表现出不同程度的抑制作用，且呈现剂量反应关系。细胞凋亡是生命的基本现象，可以维持机体内细胞数量的动态平衡，维持机体内环境的稳定，具有十分重要的生物学意义。哺乳动物细胞凋亡受基因的严格调控，研究表明Bax和Bcl-2的表达高低与细胞凋亡有密切关系，其中Bax是细胞凋亡的促进基因，Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，Bcl-2与Bax比值的升高会导致肝癌细胞凋亡发生的机率增加[5]。实验结果表明，梅花草乙醇提取物促进HepG2细胞中Bax蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，即梅花草乙醇提取物可以诱导HepG2细胞凋亡。

综上所述，梅花草乙醇提取物在体外对HepG2细胞有抑制作用，且其作用机制与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

[1]罗布桑. 蒙药学[M]. 北京：民族出版社，1989，459-460.

[2] 奥乌力吉，布和巴特尔. 传统蒙药与方剂[M]. 呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，2013，08.

[3] 王秀兰，白玉霞，王欢，等. 蒙药药理学[M]. 呼和浩特：内蒙古人民出版社，2006，82-87.

[4] 尹龙，徐亮，胡格，等. 抗肿瘤中药及其有效成分的作用研究现状[J]. 动物医学进展，2006，27(1)：39-44.

[5] 龙冬梅. 细胞凋亡及凋亡相关基因在大鼠肝癌促癌过程中的作用研究[D]. 第三军医大学(重庆)，2001.

2016年6月29日收稿

内蒙古自治区自然科学基金资助(2016MS0817)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZZ16184)

红艳，女，讲师，从事蒙药栽培与鉴定研究。

*通讯作者：辛颖，女，副教授，从事民族药物研究，E-mail：xinying20081115@163.com

R291.2

A

1006-6810(2016)10-0063-03