探讨激活Notch信号通路对人牙髓细胞增殖与分化的作用

管海洁

【摘要】 目的 探讨激活Notch信号通路对人牙髓细胞增殖与分化的作用。方法 选取完整拔除的健康前磨牙与第三磨牙， 应用酶消化法进行原代培养与传代培养。观察培养结果。结果 第4代B组人牙髓细胞中的Notch信号通路的下游基因Hesl表达量低于C组（P<0.05）；第8代， B组人牙髓细胞中的Hesl表达量与C组比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；第10代， B组人牙髓细胞中的Hesl表达量与C组比较， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Notch信号通路是进化过程中的信号转导机制， 能够细胞间作用对其命运进行控制， 牙髓细胞存在较高的增殖以及多向分化的成体干细胞， 在组织中起到非常重要的作用。

【关键词】 人牙髓细胞； Notch信号通路；增殖分化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.15.210

Notch属于穿膜受体， 其在人身体的各种器官与组织中均存在一定的涉及， 能够借助介导细胞中的局部信号进行传递与级联反应， 将邻近细胞的分析差异进行固化或者扩大， 并对细胞的凋亡、分化以及增殖功能进行有效的调控[1]。近几年来， Notch信号通路是多领域进行研究的热点问题， 伴随牙髓干细胞发现， 目前Notch信号通路是进行调控研究的重点内容。牙髓干细胞在牙源性肿瘤发病机制、牙齿组织再生与牙损伤修复中均存在一定关联， 因此掌握调控牙髓干细胞的分子机制很有必要。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料及试剂 胎牛血清、青霉素10000 U/ml， 高糖型DMEM培养基、胶原酶、200 mmol/L L-谷氨酰胺、0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亚砜、5-二苯基四氮唑溴盐、焦炭酸二乙酯。

1. 2 分组与培养 牙髓细胞主要来源：因阻生原因所拔除左下第三、左上第三磨牙；因正畸减数原因所拔除的右下第一前磨牙。将同一颗牙齿来源的牙髓细胞分为三组：A组：使用正常培养基对人牙髓细胞进行体外传代培养；B组：在正常培养基中加入r-分泌酶抑制剂DAPY， 最终浓度为5 μmol/L；C组：在正常培养基与B组培养基中同步添加等量的r-分泌酶抑制剂DAPT溶剂二甲基亚砜（DMSO）。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

第4代B组人牙髓细胞中的Notch信号通路的下游基因Hesl表达量为（49.03±16.47）×10-2低于C组的（22.08±15.64）×10-2， 比值为0.30（t=37.538， P=0.001<0.05）；第8代， B组人牙髓细胞中的Hesl表达量为（57.23±16.46）×10-2 C组为（16.25±12.44）×10-2比值为0.22 （t=29.125， P=0.001<0.05）；第10代， B组人牙髓细胞中的Hesl表达量为（58.46±15.32）×10-2C组为（14.36±14.26）×10-2比值为0.20（t=33.143， P=0.001<0.05）。

3 讨论

Notch的主要组成部分为Notch受体、Notch配体与转录因子（CSL）， 目前人体中发现了4种Notch受体， Notch受体是胞外亚基与跨膜亚基借助钙离子所依赖的共价键形成的源二聚体。跨膜亚基包含RAM23结构域、跨膜区、一个核定位序列、一组蛋白重复序列， Notch通过其RAM23结构域与锚蛋白的重复序列， 能够与DNA结合蛋白CSL进行结合[2]。目前在人类中发现的Notch配体共有5种， Notch配体也称之为DSL蛋白， 单跨膜蛋白是与受体相似的物质， 胞外区中存在表皮生长因子样的串联重复序列以及DSL结构域[3]， 其中DSL结构是与Motch受体结合不可缺失的功能结构域， 其胞内区尚未确定。

相邻细胞中的Notch受体与Notch配体完成结合后， 蛋白酶会对Notch受体进行切割， 将具有核定位信号的胞内结构域释放， 所释放出的胞内结构域进入细胞核， 与CSL结合， 并通过应答调控基因表。Notch受体与细胞配体Delta-Jagged结合， 解离Notch受体中两个亚基， 将蛋白酶激活并对其实施双重剪切， 将NICD区域（具有核定位信号）释放， NICD到达细胞核后会CSL结合， 形成复合产物， 另一方面CSL能够让其他分子形成调节复合物， 实现对下游靶基因的表达进行调控。

3. 1 牙齿发育过程中所发挥的作用 Notch信号在牙齿的产生、再生方面具有重要作用， 有文献[4]曾经指出上皮间质相互作用会对Notch基因表达进行调控， 与成牙本质细胞的分化以及成釉细胞分化存在关联， 牙齿形成阶段， 在口腔的上皮中Detal 表达较弱， 但细胞分化阶段， 其在成牙本质细胞与成釉细胞中的表达逐渐增加， 且表达模式与邻近的间质细胞Notch受体基因在表达方面互补， 除此之外Notch基因表达还存在区域特异性以及细胞类型特异性， 在间质与上皮紧密接触区域不表达， 表明口腔上皮保持Notch下调需要间质源性信号。

3. 2 在DPSCs增殖、分化中的作用 Notch信号通过不同的受体与配体介导细胞之间的相互租用， 诱导方式包含各种信号诱导以及分化。在相同细胞中， 部分细胞会在较弱的Notch信号刺激下， 定向分化， 将信号在短时间内向邻近细胞传递[5]， 且让另一方向保持未分化状态， 称之为侧向抑制。

3. 3 牙髓损伤修复中的调控 在牙齿龋损、损伤的条件下， Notch信号让DPSCs特性修复损伤组织激活。Notch受体在受伤后表达逐渐上升。受伤牙齿中Notch 1表达会与少数病变牙髓细胞相近， 但是Notch 2接近病变、远离病变间充质细胞中均表达， Notch 3在部分血管结构中表达[6， 7]。以上这些数据充分证明在牙髓损伤修复中存在Notch信号。牙髓损伤后Notch 2的表达增加， Notch 1与Notch 3的表达也随之增加， 这证明牙髓损伤后会将Notch信号激活， 成牙本质细胞与牙髓细胞分化有紧密联系， 通过对DPSCs介导进行控制修复牙髓组织。

参考文献

[1] 邹晓英， 庄姮， 岳林， 等.抑制Notch信号通路对人牙髓细胞的生物学效应.中华口腔医学杂志， 2014， 49（4）：210-215.

[2] 郑琼丹， 邢泉， 廖维立， 等. Notch信号通路参与BMP-6对人牙髓细胞增殖分化作用的研究.中华老年口腔医学杂志， 2015（2）： 65-69.

[3] 刘路， 韦曦， 吴莉萍， 等. Notch信号通路在牙髓和牙周细胞矿化及组织损伤修复中的调控作用研究.口腔生物医学， 2010， 1（4）：169-172， 185.

[4] LI Jing-hui， LIU Da-yong， ZHANG Fang-ming， et al. Human dental pulp stem cell is a promising autologous seed cell for bone tissue engineering.中华医学杂志（英文版）， 2011， 124（23）：4022-4028.

[5] 刘凤英， 许彦枝， 陈彦平， 等.中药骨碎补对人牙髓、牙龈、牙周膜成纤维细胞体外增殖的实验研究.临床和实验医学杂志， 2014（24）：2012-2015.

[6] 聂鑫， 金岩， 张勇杰， 等. dNCPs、TGF-β1及联合应用对人牙髓成纤维细胞增殖、ALP及矿化的影响. 实用口腔医学杂志， 2004， 20（2）：178-181.

[7] 赵川江， 章锦才， 徐琛蓉， 等. 人釉原蛋白基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学活性的影响. 中山大学学报（医学科学版）， 2006， 27（z2）：25-27.

[收稿日期：2016-01-07]