MTHFR基因多态性与蒙古族绝经后妇女骨质疏松的相关性研究

郭志英，栗平，罗云娜，张淑珍，武志锋

(内蒙古医科大学第二附属医院功能科，内蒙古 呼和浩特　010030)



MTHFR基因多态性与蒙古族绝经后妇女骨质疏松的相关性研究

郭志英，栗平，罗云娜，张淑珍，武志锋

(内蒙古医科大学第二附属医院功能科，内蒙古 呼和浩特010030)

摘要：目的探讨本地区蒙古族绝经后妇女亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因的多态性位点C677T、A1298C基因多态性与内蒙古地区蒙古族绝经后女性骨质疏松症(osteoporosis，OP)遗传易感性的关系。方法收集150 例门诊及住院(确诊为骨质疏松)蒙古族绝经后妇女为观察组，对照组来自门诊按年龄配比的骨含量正常的蒙古族绝经后妇女145 例，均以双能X线骨密度仪测定腰椎和髋部骨密度，以T值≤-2.5诊断为骨质疏松，-2.5≤T≤-1.0为骨含量减少，T值>-1.0为骨含量正常，并进行MTHFR C677T及A1298C基因多态性检测。结果骨质疏松组MTHFR基因受体C677T基因型CC、CT、TT频率分别为29.3%、44.0%和27.7%，对照组基因型CC、CT、TT频率分别为42.8%、44.8%和12.4%，两组差异有统计学意义(P=0.017)。骨质疏松症组中的T等位基因频率为48.7%，显著高于对照组(34.8%，P=0.005)，提示T等位基因是骨质疏松发生的危险因素(OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。与CC基因型相比，TT基因型携带者的骨质疏松发生风险增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)，该作用在年龄≥60 岁及体重指数偏高的女性中表现更明显。而MTHFR A1298C的多态性位点对绝经后骨质疏松的发生没有显著影响(P=0.513)。结论MTHFR C677T基因变异与蒙古族绝经后妇女骨质疏松易感性明显相关，MTHFR A1298C的多态性位点与蒙古族绝经后妇女骨质疏松的发生没有明显相关性。

关键词：骨质疏松症；亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；绝经后妇女

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是老年女性人群中常见的一种代谢性骨病，其特点为高转换型骨量丢失、骨吸收大于骨形成而易致骨折发生。一旦发生骨折，将会影响老年女性的生存质量，严重时可致残甚至致死。因此，有关PMOP的防治研究具有非常重要的临床价值与现实意义。PMOP作为遗传与环境因素共同作用的一类复杂性疾病受诸多因素的影响，而基因所起的作用占70%左右[1]，如维生素D受体基因、雌激素受体基因、Ⅰ型胶原蛋白等[2-4]。新近报道的白介素-6(interleukin-6，IL-6)在日本女性人群中也与骨质疏松密切相关[5]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)基因是影响骨质疏松及骨质疏松性骨折发病的重要候选基因之一，它是叶酸代谢通路上参与DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。本研究拟采用以妇女为基础的病例-对照研究方法，探讨MTHFR基因的功能性SNPs位点(C677T和A1298C)与我国内蒙古地区蒙古族妇女绝经后骨质疏松易感性的关系，进一步阐明绝经后骨质疏松症的可能分子机制，为骨质疏松症的防治提供理论基础和新的线索。

1资料与方法

1.1对象入选病例要求为55～75 岁门诊及住院骨质疏松女性患者，蒙古族聚居区三代纯蒙古族，年龄方面保持均衡，具有可比性。排除有影响骨代谢的疾病及其他需长期治疗的严重慢性疾病者，共有150 例患者作为观察组纳入调查。对照组为来自门诊体检的同条件女性蒙古族人群，均由专业人员采用双能X线骨密度仪对研究对象进行腰椎及双侧股骨近端股骨颈骨密度测定，以T值≤-2.5诊断为骨质疏松，-2.5≤T≤-1.0为骨含量减少，T值>-1.0为骨含量正常。

1.2方法每个样本对象抽取5 mL静脉血，分装于EDTA抗凝管中，用于提取基因组DNA，收集好的抗凝血贮存于-80℃冰箱备用。本研究的标本收集均经本医院伦理委员会认可并获得患者知情同意。采用OMEGA D3392全血DNA小量提取试剂盒(上海玉博生物科技有限公司)提取DNA，按常规蛋白酶K、酚/氯仿法提取，然后由聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测295 例样本C677T、A1298C基因型分布情况。C677T引物序列如下：上游引物：5′GGGGTCAGAAGCATATCAGT-3′；下游引物：5′-CTCACCTGGATGGGAAAGA-3′。A1298C引物序列如下：上游引物：5′GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG-3′；下游引物：5′-TCTCCCGAGAGGTAAAGAACAAA-3′。扩增参数：50℃预热2 min，95℃预变性10 min，然后95℃变性15 s，62℃复性1 min，共40个循环，400V恒温电压、2%琼脂糖胶电泳，电泳15 min后取胶。扩增后用紫外线凝胶图像分析系统分析并保存，最后在荧光定量PCR仪(7700型，ABI公司)上检测荧光信号。

酶切反应总体积15 μL，包括10 μL PCR扩增产物，1 μL TapⅠ(1U)内切酶，2 μL的10×Buffer TapⅠ，2 μL的H2O。65℃水浴过夜，400 V恒温电压、2%琼脂糖胶电泳，电泳15 min后取胶，应用凝胶成像仪判断酶切结果。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。根据Hardy-Weinberg定律，比较各组基因型和等位基因频率的实际数与预期数，了解各基因型在人群中遗传平衡符合程度。两组之间的基因和等位基因频率差异进行卡方检验，并计算比值比。

2结果

2.1Hardy-Weinberg遗传平衡检验对照组145 例中，两种基因型在对照组中的分布规律均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(见表1～2)。

表1　Hardy-Weinberg平衡检验

表2　研究对象基本资料±s)

2.2骨质疏松组和对照组MTHFR中两个多态性位点基因型比较对照组MTHFR C677T基因型频率：CC 42.8%、CT44.8%和TT 12.4%，而骨质疏松组的基因型频率：CC9.3%、CT 44.0%和TT 27.7%。骨质疏松组和对照组CC、CT、TT种基因型分布频率的差异有统计学意义(χ2=8.155，P=0.017)。骨质疏松组中C、T等位基因频率为51.3%、48.7%，对照组为65.2%、34.8%，骨质疏松组和对照组的C、T等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=7.920，P=0.005)。T的骨质疏松发生风险是C的1.77倍(95% CI=1.18～2.64，P=0.001)。与CC纯合子比较，TT纯合子的骨折风险增加至3.15倍(95% CI=1.45～6.86，P=0.004)。

MTHFR A1298C的3种基因型频率在骨质疏松组中分别为：AA 62.7%、AC 20.0%和CC 17.3%，而对照组基因型分布为AA 66.2%、CC 22.1%和CC 11.7%。A1298C基因型多态性位点和骨质疏松易感性无明显相关(χ2=1.335，P=0.513)。详细资料见表3。

表3　病例组和对照组中MTHFR两个多态性位点基因型比较

3讨论

骨质疏松是一种普通的代谢性骨病，是众所周知的“沉默病”，往往没有症状，直到髋部受到轻微创伤发生骨折才被人们所关注，该病已成为全球重要的公共卫生问题之一[11]。其特征为骨量下降、骨骼脆性增加和骨组织微观结构破坏，最终引起骨折发生率增加。骨质疏松性骨折是老年人群残疾和间接死亡的最主要原因，严重影响老年人晚年生活质量。本研究旨在研究MTHFR基因多态性位点C677T、A1298C基因多态性与内蒙古地区蒙古族绝经后女性骨质疏松症遗传易感性的关系，发现C677T基因变异与内蒙古地区蒙古族绝经后女性骨质疏松症易感性明显相关。如果能从基因方向找到老年骨质疏松症的根本性原因，将对骨质疏松症的预防和治疗产生积极影响。

近年来遗传因素对骨质疏松及骨质疏松性骨折发病率的影响逐步受到重视。亚甲基四氢叶酸还原酶基因是影响骨质疏松及骨质疏松性骨折发病的重要候选基因之一，它是叶酸代谢通路上参与DNA正常合成和甲基化的重要基因之一。MTHFR是一种黄素依赖蛋白，定位于染色体lp36.3，作为同型半胱氨酸代谢再甲基化途径中的关键酶，同型半胱氨酸是含硫醇的氨基酸，形成于蛋氨酸代谢中。MTHFR普遍存在于人、动物及其他原核、真核生物体内，哺乳类动物以肝脏分布最多，能将5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-亚甲基四氢叶酸，为同型半胱氨酸转变为蛋氨酸参加代谢提供甲基，此环节受阻可导致同型半胱氨酸在体内蓄积。有研究还发现，MTHFR的基因C677T纯合子突变型TT基因型患者血中同型半胱氨酸浓度高于野生型基因型(CC型)。近年来澳大利亚的Wong等[7]对老年人半胱氨酸水平的研究支持这一结果。而CT基因型血同型半胱氨酸浓度介于两者之间，从而引起一系列病理生理过程[8-9]，继而与多种疾病的发生(如复发性流产、脑卒中、冠心病及神经管畸形等等)产生一定关联[10-13]。有一些研究报道认为，该基因多态性与骨质疏松性骨折或低BMD风险增加有关。然而，也有研究未能确证这种关联。例如，近来在墨西哥人群的基因检测证实了MTHFR C677T与骨质疏松的遗传易感性[14]。相反，Golbahar等发现该基因多态性与伊朗女性股骨颈或腰椎BMD没有关联。我国香港人群的研究结果也显示，MTHFR C677T与骨质疏松性骨折发病风险无关[15]。这些研究结果的差异可能部分由于研究人群的不同，如种族、年龄、环境和遗传修饰。

本研究从分子流行病学角度探讨了MTHFR基因的2个多态性位点(A677T和A1298C)与绝经后妇女骨质疏松发病风险之间的关系。而在以上相关研究中，A1298C多态性位点与疾病的关系并不密切。近年来对于MTHFR的研究日益广泛，我国仅有该基因与江苏地区绝经后女性的相关性报道，其他地区鲜见。本次研究的主要目的在于找出该基因与老年人骨质疏松的关系，以期达到及早预防和治疗的目的，最大幅度降低老年人晚年因骨质疏松乃至骨折带来的对个人、家庭及社会的重大负担。

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Association of Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) Polymorphism with Osteoporosis in Mongolian Postmenopausal Women

Guo Zhiying，Li Ping，Luo Yunna，etal

(The Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010030，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)gene C677T、A1298C polymorphisms and osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.MethodsOne hundred and fifty postmenopausal female patients with osteoporosiswere enrolled.one hundred and forty-five contrasts were healthy Mongolian postmenopausal women outpatients matched with age to conduct a case-control study.Bone mineral density (BMD) at lumbar spine，femoral neck，trochanter and Ward′s triangle were measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).The T value is less than or equal to -2.5 for the diagnosis of osteoporosis；-2.5≤T≤-1.0 for bone decreased；the T≥-1.0 content of normal bone.and MTHFR gene polymorphism measurement were performed to all subjects.ResultsThe frequencies of MTHFR C677T Genotype CC、CT and TT in osteoprosis group were 29.3%，44.0% and 27.7%，respectively，in the contrasts group.The frequencies of MTHFR were 42.8%、44.8% and 12.4%.the difference between groups was statistically significant (P=0.017).The frequencies of T allelic genes was 48.7% in osteoporosis group，evidently higer than that in contrast group (34.8%，P=0.005).T was the risk factor of osteoporosis (OR=1.77，95% CI=1.18～2.64，P=0.001).Comparing to the CC，TT genotype carriers loose osteoporosis risk increases to 3.15 times (95% CI=1.45～6.86，P=0.004).On the otherside，Polymorphism of MTHFR A 1298C on the occurrence of postmenopausal osteoporosis had no significant effect (P=0.513).The effect was more obvious in 60 years of age or elder and high BMI in women.ConclusionThe MTHFR C677T polymorphism may contribute to the susceptibility of osteoporosis in Mongolian postmenopausal women.

Key words：osteoporosis；methylene tetrahydrofolate reductase；genic polymorphism；postmenopausal women

作者简介：郭志英(1979- )，女，主治医师，内蒙古医科大学第二附属医院功能科，010030。

收稿日期：2015-08-25

中图分类号：R322.7+1

文献标识码：A

基金项目：内蒙古医科大学第二附属医院院级科研项目(2013YJJ29)