miR-217通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移的作用及机制研究*

雷微　邓明明

(四川医科大学附属第一医院消化科, 四川 泸州 646000)



·论著·

miR-217通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移的作用及机制研究*

雷微邓明明

(四川医科大学附属第一医院消化科, 四川 泸州 646000)

【摘要】目的探讨miRNA-217(miR-217)抑制胃癌细胞转移的作用及其机制。方法qRT-PCR法比较胃癌组织、癌旁组织、胃癌细胞系和正常胃上皮细胞中miR-217的表达差异。转染miR-217 mimics或Inhibitors后，通过Transwell侵袭实验观察miR-217的胃癌细胞转移能力的影响；建立裸鼠尾静脉转移模型，观察稳定表达miR-217在体内对胃癌转移能力的影响；生物信息学分析miR-217的候选靶基因为14-3-3ν，荧光素酶报告基因实验检测SGC7901细胞中miR-217过表达对野生型和突变型14-3-3ν荧光素酶活性的影响。Western blot检测miR-217对14-3-3ν野生型和突变体蛋白表达的影响。结果miR-217在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.01)；在各胃癌细胞中的表达量较正常胃上皮细胞GES显著降低(P<0.01)。miR-217 mimics抑制SGC7901细胞的侵袭能力，与阴性对照的差异有统计学意义(P<0.01)。而miR-217 inhibitors明显促进SGC7901细胞的侵袭能力(P<0.01)；体内实验发现稳定过表达miR-217的SGC7901细胞转移能力明显降低。荧光素酶报告基因结果证实miR-217能够抑制14-3-3ν的3′-UTR区荧光素酶活性；Western blot结果显示转染miR-217后，SGC7901细胞中的14-3-3ν蛋白水平明显低于对照组；Western blotting结果显示miR-217过表达显著抑制14-3-3ν-wt，而不能抑制14-3-3ν-mut的蛋白表达。结论miR-217能够通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移，促进miR-217的表达或抑制14-3-3ν的表达可能是抑制胃癌转移的有效手段。

【关键词】胃癌；转移；微小RNA；微小RNA-217；14-3-3ν

胃癌是我国的主要恶性肿瘤之一，占肿瘤相关死亡人数占42.5%，是各类癌症死亡率的第三位[1]。大多数患者发现胃癌时已发生临近器官或者远处转移，成为胃癌患者的主要死因。微小RNA(miRNA，miR)，即20-24个核苷酸的是近年来发现的一类通过与靶基因的mRNA发生特异性结合而发挥转录后负性调控作用的非编码小RNA[2]。多种miRNA已被证实通过调控下游靶基因，在胃癌侵袭和转移恶性生物学行为中发挥关键作用[3, 4]。有研究发现miR-217能够靶向KRAS抑制胰腺癌生长[5]，miR-217还能够靶向E2F3抑制肝癌转移[6]。然而，miR-217在胃癌中的作用尚不清楚。本研究通过探索miR-217在胃癌转移过程中的作用及其分子机制，为抑制胃癌转移提供新的有效治疗靶点。

1材料与方法

1.1标本与细胞收集2014年3月～6月我院普通外科胃癌组织和对应正常组织标本各20例。其中男14例，女6例；年龄36～63岁，中位年龄53岁。胃癌标本、对应正常组织均得到病理证实。胃永生化正常上皮细胞GES，胃癌细胞AGS、MKN28、SGC7901、BGC823、MKN45均保存于我院。

1.2实验耗材RPMI-1640、胎牛血清均购自美国Gibco公司。miR-217 mimics 和inhibitor均购自广州锐博生物科技有限公司。Dual-luciferase检测试剂盒购自美国Pormega公司。Transwell培养小室购于Corning公司。鼠抗人β-actin单克隆抗体购于Sigma公司，兔抗人14-3-3ν抗体购于Cell signaling公司。

1.3方法

1.3.1细胞转染取正常生长的SGC7901细胞，消化后重新接种到相应的6孔板，培养24 h后进行转染。利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000并参照其转染步骤将NC或miR-217 mimics或inhibitors转染到SGC7901细胞中，终浓度为100 nmol/L，转染6 h后更换为完全培养基。

1.3.2RNA提取和qRT-PCR细胞经过不同处理后，加入TRIzol充分裂解。每1 ml TRIzol加入0.3 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置15 min，4℃下12000 g离心15 min，小心转移上层水相至新EP管中，加入05 ml异丙醇后混匀，4℃下12000 g离心20 min，弃上清，加入 1 ml 75 % 乙醇，洗涤RNA沉淀，4℃下12000 g 离心5 min；加入适量DEPC水溶解后于-80℃保存备用。反转录和qRT-PCR引物均购自广州锐博公司。qRT-PCR采用茎环法SYBR green PCR mix(Takara)对miRNA进行定量分析，所有反应在8联管中进行，扩增反应采用三复孔；反应体系为20 μl，包含SYBR Green PCR Master Mixture试剂10 μl，cDNA模版2 μl，上下游引物各0.8 μl，去离子水H2O 6.4 μl；扩增程序：95℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，15 s，40个循环；U6为内参。

1.3.3靶基因预测 使用Targetscan，PicTar，miranda等miRNA靶基因数据库共同预测，对靶基因3′-UTR区与miR-217种子序列进行碱基互补比对并计算结合稳定性，同时检查该基因的miR-217结合区域是否具有保守型。

1.3.4双荧光素酶报告基因实验与验证构建野生型全长14-3-3ν的3′UTR的质粒，并通过定点突变技术构建突变型载体。将NC或miR-217以及14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut载体共转到胃癌细胞中。转染48 h后，每孔加入1 X PLB裂解液100 μl，裂解15 min，将裂解液转移到1.5 ml的EP管中， 4℃下10000 g离心5 min。转移上清到新的EP管中待测。在EP管中加入LAR 底物40 μl，加入10 μl稀释的上清，酶标仪读取Renilla荧光素酶的荧光值。加入终止试剂40 μl，立即读取firefly荧光素酶荧光值。用比值计算各样本荧光强度。

1.3.5Transwell实验将转染NC或miR-217 48 h后的SGC7901细胞消化计数，并用无血清的培养基重悬， 分别接种到平衡后的Insert小室中，下室的24孔板中加入含有10% FBS的培养基，37℃ 下培养24 h后取出。擦除未穿孔的上室细胞、甲醇固定15 min后0.1%结晶紫染色40 min，显微镜下观察并计数。

1.3.6Western blotting法检测转移和凋亡相关蛋白表达细胞经过不同处理后，提取总蛋白，并测定蛋白浓度；每孔30 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，半干转至NC膜，5 %脱脂奶粉室温封闭1h后，分别一抗(14-3-3ν，1∶1000；β-actin，1∶2000)4 ℃下孵育过夜。TBST漂洗后，再加HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后，采用化学发光法显影。

1.3.7裸鼠体内转移实验5～7 周龄雄性裸鼠，在恒温恒湿环境下饲养。取稳定表达miR-217或NC的Luciferase标记的SGC7901细胞细胞，消化计数并调整浓度至 1×107个/ml，每只裸鼠尾静脉注射 0.2 ml，每组接种7只，自接种日起每周观察 1 次。7 周后，利用小动物成像系统观察Luciferase信号强度。

1.4统计学分析每次实验至少重复三次，用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，均数的比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1miR-217在胃癌组织和胃癌细胞中的表达情况我们首先通过qRT-PCR验证miR-217在20对胃癌与对应癌旁组织中的表达。结果表明，miR-217在胃癌组织中表达显著高于对应癌旁组织(P<0.05)(图1 A)。同时，我们发现miR-217在多个胃癌细胞系的表达比永生化正常上皮细胞GES明显下降(P<0.05)(图1 B)。这些结果提示miR-217可能在胃癌发生发展中具有重要作用。

图1miR-217在胃癌和癌旁组织，胃癌细胞系和正常胃黏膜永生化细胞系中的表达情况

Figure 1miR-217 expression in gastric cancer, adjacent normal tissues, gastric cancer cell line and normal immortalized gastric epithelial cells

注：A.qRT-PCR检测miR-217在20对胃癌及癌旁组织中的表达；B.qRT-PCR检测miR-217在胃癌细胞系和正常胃癌上皮细胞中的表达

2.2miR-217过表达能够抑制胃癌细胞迁移侵袭能力为明确miR-217在胃癌转移中的作用，分别用miR-217 mimics或inhibitors上调或抑制其表达(图2 A)，观察对胃癌细胞转移能力的影响。Transwell结果发现过表达miR-217 mimics细胞中，迁移细胞数为(86±16)个/200倍视野，而NC组迁移细胞数(159±3)个/200倍视野，差异有统计学意义。而在SGC7901细胞中转入miR-217 inhibitors下调其表达，其迁移细胞数为(215±30)个/200倍视野，而NC组迁移细胞数(145±23)个/200倍视野，细胞迁移和侵袭能力明显增强(P<0.05)(图2B、C)。

我们进一步构建了miR-217的慢病毒表达载体及其对照载体，并分别感染稳定表达Luciferase的SGC7901细胞，分别命名为LV-miR-217和LV-NC。qRT-PCR证实miR-217在稳定表达细胞系中高表达(P<0.05)(图2D)。取14只裸鼠，随机分为2组后，通过尾静脉注射分别建立胃癌体内转移裸鼠模型。7周后，采用体内成像系统，观察胃癌转移情况。发现尾静脉注射后LV-miR-217细胞的裸鼠中，Luciferase信号比LV-NC组明显降低。在LV-NC组中，7只裸鼠仅有1只发现转移灶；而在LV-miR-217组中，有5只裸鼠发现转移灶(P<0.05)(图2 E)。这些结果表明，miR-217能够明显降低SGC7901细胞的转移能力。

2.314-3-3ν是miR-217的靶基因我们通过Targetscan等生物信息学软件预测，发现14-3-3ν是miR-217的靶基因(图3A)。我们构建了野生型(wt)和突变型(mut)14-3-3ν荧光素酶报告基因载体。将14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut质粒分别与miR-217质粒、空载体(NC)共转染，或单独转染(Vehicle) SGC7901细胞。48 h后检测细胞的荧光素酶活性。结果显示：14-3-3ν-wt与miR-217质粒共转染组荧光素酶活性为0.55±0.6，较NC组荧光素酶活性(1.0±0.10)和空白对照组荧光素酶活性(0.95±0.11)，差异有统计学意义(P<0.05)，阴性对照与空白对照相比，差异无统计学意义(P>0.05)。而14-3-3ν-mut与miR-217共转染组荧光素酶活性为0.95±0.05，与阴性对照组荧光素酶活性(0.94±0.09)和空白对照荧光素酶活性(0.98±0.09)比较，差异无统计学意义(P>0.05) (图3B)。这些结果提示miR-217过表达显著抑制14-3-3ν-wt荧光素酶的活性；而对在14-3-3ν-mut的荧光素酶活性没有明显抑制作用。

Western blot结果显示，SGC7901细胞过表达miR-217后，14-3-3ν的 mRNA和蛋白表达均明显低于NC(图3C)。用 miR-217 的抑制剂下调 GC9811 细胞中 miR-217 的表达时，14-3-3ν的mRNA和蛋白表达均升高，提示 miR-217 负性调控 14-3-3ν的表达。

我们将14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut的表达载体分别转入SGC7901细胞中，western blot检测发现其14-3-3ν表达均明显上调。转染miR-217后，发现14-3-3ν-wt明显能被miR-217抑制，然而3′-UTR突变的14-3-3ν-mut的表达并没有被miR-217下调(图3D)，说明miR-217通过作用于14-3-3ν的3′-UTR来抑制其表达。

3讨论

本研究在胃癌中开展miR-217的功能探讨，我们通过检测miR-217在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达阐明了miR-217通过其下游靶基因14-3-3ν抑制胃癌转移的作用及机制，为将miR-217作为胃癌的分子标志物以及转移靶向分子提供了重要依据。

图2体内外实验表明miR-217能够抑制胃癌转移

Figure.2 miR-217 inhibited metastasis of gastric cancer both in vitro and in vivo

注：A.转染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR检测miR-217表达；B、C.Transwell检测转染miR-217 mimics或inhibitors对SGC7901细胞转移能力的影响；D.稳定转染miR-217或对照慢病毒后，qRT-PCR检测miR-217的表达情况；E.体内转移模型检测稳定转染miR-217对SGC7901细胞转移能力的影响

MicroRNA 通过作用于靶基因mRNA的3′非编码区，抑制其翻译或促进其降解，在转录后水平负性调控靶基因的表达[2, 4, 7]。近来研究也证实microRNA参与了肿瘤发生和演进的各个阶段，如转移、增殖和耐药[8-10]。胃癌转移涉及侵袭基膜、体内播散、远端定殖等多个过程[2, 3]。miRNA作为基因的重要调控分子，参与转移的各个步骤[10]。已有研究提示miR-217可能在肿瘤转移中发挥重要作用，但先前的研究表明miR-217在不同的恶性肿瘤中所发挥的功能不一致[11-13]。研究发现miR-217能够靶向KRAS抑制胰腺癌生长[5]，miR-217还能够靶向E2F3抑制肝癌转移[6]，也有研究发现miR-217具有促癌作用[14]。本研究通过体内外实验都证明miR-217的过表达能引起胃癌细胞转移能力的下降，进一步通过荧光素酶报告基因实验证实miR-217通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移的机制。miR-217的作用可能并非仅集中在抑制侵袭转移方面，可能在多种胃癌恶性生物学行为中发挥作用，还有待更多的实验证明。14-3-3家族分子在肿瘤中具有重要作用[15-17]，其中，14-3-3ν是14-3-3家族中的重要成员，在肺癌、乳腺癌中高表达，并与患者预后相关[16, 17]。在肺癌中，14-3-3ν受到p53的抑制。当p53缺失时，14-3-3ν表达增高，可能参与肺癌的发生发展[16, 18]。本研究率先发现miR-217能够直接靶向14-3-3ν，抑制胃癌转移。这些结果提示，14-3-3ν发挥了癌基因的作用，在胃癌等多种肿瘤的恶性生物学表型的发生发展中发挥了重要作用。

图314-3-3ν是miR-217的靶基因

Figure 314-3-3ν is a target gene of miR-217

注：A。生物信息学分析miR-217与14-3-3ν的结合位点；B.SGC7901细胞分别共转染Luc-14-3-3ν-wt或Luc-14-3-3ν-mut和NC或miR-217后，检测相对Luciferase荧光值。分别转染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR检测miR-217的表达情况；C.SGC7901细胞转染miR-217 mimics或inhibitors后，14-3-3ν mRNA和蛋白的表达情况；D.SGC7901细胞转染14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut，或同时转染miR-217 mimics后，检测14-3-3ν的蛋白表达

4结论

本研究发现miR-217/ 14-3-3ν这一抑制胃癌转移的重要通路，为胃癌靶向治疗提供了新的潜在靶点。通过恢复miR-217的表达或抑制14-3-3ν的表达，有可能提高胃癌转移的治疗效果。

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miR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν

LEI Wei,DENG Mingming

(DepartmentofDigestiveDiseases,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and mechanisms of miRNA-217 (miR-217) in inhibition of gastric cancer metastasis. MethodsqRT-PCR was used to evaluate miR-217 expression between gastric cancer tissues and paired adjacent tissues, gastric cancer cell lines and normal gastric epithelial cells. After transfection of miR-217 mimics or Inhibitors, transwell invasion assay was applied to the effect of miR-217 in gastric cancer cell metastasis; metastasis model in nude mice was used to observe the effect of miR-217 overexpression in metastasis of gastric cancer in vivo; Bioinformatics analysis revealed 14-3-3ν as a candidate target genes of miR-217. Luciferase activity of the luciferase reporter assay was used to detect the effect of miR-217 on wild-type and mutant 14-3-3ν in SGC7901 cells. Western blot was used to evaluate whether miR-217 affect protein expression of 14-3-3ν and its mutant. ResultsThe expression of miR-217 in gastric cancer tissues was significantly decreased, compared with adjacent normal tissues (P<0.01). miR-217 expression level in the gastric cancer cells was significantly reduced, compared with normal gastric epithelial cell GES (P<0.01). MiR-217 mimics significantly inhibited invasion of SGC7901 cells, compared with the negative control (P<0.01). While miR-217 inhibitors significantly promoted invasion of SGC7901 cells (P<0.01); stable expression of miR-217 in SGC7901 cells demonstrated a reduced invasion capacity in vivo. Luciferase reporter assay showed that miR-217 inhibited luciferase activity of 14-3-3ν by targeting its 3′-UTR region; Western blot assay showed SGC7901 cells transfected with miR-217 significantly decreased 14-3-3ν expression, compared with the negative control. Western blotting showed that overexpression of miR-217 significantly inhibited the expression of14-3-3ν-wt, but not 14-3-3ν-mut. Conclusion MiR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν. Restore of miR-217 expression or 14-3-3ν inhibition may be effective for the treatment of gastric cancer metastasis.

【Key words】Gastric cancer; Metastasis; miRNA; miR-217; 14-3-3ν

(收稿日期：2015-09-27； 编辑： 何兴华)

【中图分类号】R 735.2

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.003

通讯作者：雷微，E-mail：hileiwei@163.com

基金项目：国家自然科学基金(30973422)