大鼠脑缺血损伤后髓过氧化物酶的活性变化以及蒙药嘎日迪-13的干预作用

曹丽霞 何静波 郑延泽 张浩楠 田彩云 武海军 杨玉梅

(包头医学院心血管研究室， 内蒙古 包头 014040)

实验研究

大鼠脑缺血损伤后髓过氧化物酶的活性变化以及蒙药嘎日迪-13的干预作用

曹丽霞 何静波 郑延泽 张浩楠 田彩云 武海军 杨玉梅*

(包头医学院心血管研究室， 内蒙古 包头 014040)

目的：探讨脑缺血损伤后不同时相脑组织和血清中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性变化以及蒙药嘎日迪-13对其的影响。方法:取雄性SD大鼠360只，将大鼠随机分为假手术组、脑缺血模型组、嘎日迪-13大剂量组、嘎日迪-13中剂量组、嘎日迪-13小剂量5个组，每组又随机分为缺血1 h组、6 h组、12 h组、24 h组、72 h组与120 h组6个时相组，嘎日迪-13 大、中、小给药组分别以1.2 g/100mL、0.6 g/100mL和0.3 g/100mL浓度2mL/100g灌胃，1次/d，连续27d后，采用改良Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，进行神经功能评分，在各时相规定时间点麻醉大鼠后从腹主动脉采血并取脑组织，采用分光光度法检测MPO活性。结果:与假手术组比较，脑缺血模型组各时相脑组织和血清中MPO活性都明显升高(P< 0. 05)，具有显著性差异；与脑缺血模型组比较，嘎日迪-13大、中、小剂量组各时相脑组织和血清中MPO活性都明显降低，与模型组比较具有显著性差异(P<0. 05)，且24h时作用尤为明显(P<0. 01)。结论:嘎日迪-13可能是通过减少脑缺血损伤后各时相MPO活性，调节各时相炎症因子相互之间的作用，减轻脑组织损伤，从而发挥对脑缺血损伤的保护作用。

嘎日迪-13；脑缺血；MPO

近年来，脑缺血损伤的研究中主要集中在缺血后的炎症反应过程。炎症反应在脑缺血损伤后的病程的发生、发展及预后扮演了非常重要的角色。大量的实验研究表明，炎症反应介导了脑组织缺血缺氧损伤，其中白细胞特别是中性粒细胞的聚集、浸润是炎症反应发生和发展的关键环节。髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 活性作为评价中性粒细胞组织浸润程度的重要指标之一，在近些年来的研究中颇受关注。利用其可以使过氧化氢还原这一特性不仅可以评价酶的活力，而且可定量测定中性粒细胞的数目，从而反映中性粒细胞的浸润和炎症损伤程度。本研究室前期已从宏观、功能、生理、生化等多方面证明[1-2]蒙药嘎日迪-13对缺血性脑损伤具有明显的保护作用。本文采用分光光度法观察了嘎日迪-13对大鼠脑缺血损伤后不同时相脑组织和血清中髓过氧化物酶的活性变化，来进一步探讨嘎日迪-13对缺血性脑损伤保护的作用机制。

1 材料

1.1 动物：清洁级SD大鼠(体重150～250 g)，雄性，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证编号SCXK(京)2011-0012。

1.2 药物与试剂：嘎日迪-13，内蒙古奥特奇蒙药股份有限公司(金山)蒙药厂，批号：080905； MPO试剂盒，南京建成生物科技有限公司，批号：A044。

1.3 主要仪器: UV765紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TGL-16G高速离心机，上海安亭科学技术仪器厂；IYZKM电子恒温水浴锅，北京市光明医疗仪器厂。

2 方法

2.1 动物分组及给药：SD大鼠，雄性，360只。随机分为5个大组，即假手术组(Sham)、模型组(Model)、嘎日迪-13大剂量组(Garidi L)、嘎日迪-13中剂量组(Garidi M)和嘎日迪-13小剂量组(Garidi S)；每个大组又分为6个小组，分别为1 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h组，每组12只大鼠。嘎日迪-13大、中、小剂量组分别以2 mL/100g灌胃给药，给药剂量分别是0.24 g/kg、0.12 g/kg和0.06 g/kg；假手术组和模型组分别给予等容量生理盐水。各组连续灌胃27 d，1次/d，末次给药1h后制备模型，造模后不再进行给药干预。

2.2 局灶性脑缺血模型的建立：采用线栓法大脑中动脉闭塞方法制备局灶性永久型大鼠脑缺血模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.1 mL/100 g麻醉后，取仰卧位固定并用碘伏消毒，在颈正中做切口，分离暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎CCA、ECA近心端，于靠近ICA与ECA分叉处剪一V形小口，从CCA向ICA缓慢插入栓线，结扎ICA固定栓线，逐层关闭肌肉缝合皮肤。假手术组仅分离和结扎左侧CCA、ECA和ICA，不插入栓线。各组大鼠造模2h后采用Zea Longa[3]评分标准进行神经功能的评分，以出现Homer征(即同侧眼球下陷，睑裂变小，瞳孔缩小)以及1<评分<4分者为模型成功，其他剔除。

2.3 脑组织及血清中MPO活性的测定：在规定时间点，麻醉大鼠后腹主动脉取血，室温放置2小时，离心取上层血清；断头取缺血侧脑组织，制备脑匀浆。采用MPO试剂盒测定脑组织和血清中MPO的活性水平。

3 结果

3.1 嘎日迪-13对神经功能评分的影响：神经功能评分结果显示，假手术组大鼠未出现神经功能障碍，而脑缺血模型组各时相神经功能评分较假手术组显著升高(P<0.01)，表明大鼠脑缺血模型制作成功；嘎日迪-13各剂量组神经功能评分较同时相模型组比较显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 嘎日迪-13对脑缺血大鼠神经功能评分的影响

与假手术组比较**P<0.01，与模型组比较##P<0.01

3.2 嘎日迪-13对不同时相脑组织和血清中MPO活性的影响

3.2.1 嘎日迪-13对不同时相脑组织中MPO活性的影响：与假手术组比较，各时相脑缺血模型组大鼠脑组织中MPO活性明显升高，24 h达到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手术组(P< 0. 05)；与脑缺血模型组比较，各时相嘎日迪-13大、中、小剂量组大鼠脑组织中MPO活性明显降低(P<0. 05)，但增长趋势和模型组相同，在24 h达到高峰，72 h后有所下降。见表2。

表2 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠脑组织中MPO活性的影响

与假手术组比较*P<0.05，与模型组比较#P<0.05

3.2.2 嘎日迪-13对不同时相血清中MPO活性的影响：各时相脑缺血模型组与假手术组比较，大鼠血清中MPO活性明显升高，于24 h达到高峰，72 h后有所下降，但仍高于假手术组(P< 0. 05)；嘎日迪-13大、中、小剂量组大鼠血清中MPO活性较同时相模型组比较显著降低(P<0. 05)，但增长趋势和模型组相同，在24 h达到高峰，72 h后有所下降。见表3。

表3 嘎日迪-13在不同时相对局灶性脑缺血大鼠血清中MPO活性的影响

与假手术组比较*P<0.05，与模型组比较#P<0.05

4 讨论

脑组织缺血缺氧后会引发一系列的病理改变，其中有关中性粒细胞所引发的炎症反应过程在近些年来的研究中备受关注。研究表明，炎症反应是造成缺血后脑损伤的主要原因之一。脑组织缺血早期的炎症反应会加重神经细胞的损害作用，而晚期炎症反应对神经细胞的再生和恢复有益[4-5]。中性粒细胞浸润和活化又是介导脑缺血炎症级联反应的重要环节。当中性粒细胞在缺血脑组织中黏附、积聚、浸润，从而释放大量的炎症介质，是导致继发性脑损伤的主要原因[6]；通过抑制中性粒细胞的黏附和浸润或使用药物来减少中性粒细胞的总数能够减轻缺血性脑损伤[7-8]。MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞嗜天青颗粒分泌的一种重要的过氧化物酶，它可以特异性标记和激活中性粒细胞[9]。因此，MPO水平及活性变化是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的重要观测指标[10]。

本实验结果显示，模型组大鼠脑组织和血清中MPO活性较假手术组明显升高，提示MPO参与了脑缺血后神经病理损伤，并且在脑缺血后1h开始表达，24h达到高峰，随后表达开始降低，这与文献报道基本一致[11]。本实验结果还显示，嘎日迪-13给药组可显著降低大鼠脑组织和血清中MPO活性，在脑缺血后24h作用最明显，提示嘎日迪-13对脑缺血损伤具有保护作用，且大剂量嘎日迪-13的保护效果更为显著。实验结果提示，嘎日迪-13可显著降低模型组大鼠脑组织和血清中MPO活性，改善脑缺血后脑组织和血清中中性粒细胞在缺血区的聚集、黏附和浸润，从而减轻脑缺血后的炎症反应发挥对脑缺血损伤的治疗作用。

脑缺血后中性粒细胞在体内存在着复杂的相互关系，它们之间通过合成和分泌的相互调节。由此可推测，嘎日迪-13可能是通过调节MPO活性的表达、合成和分泌以及相互之间的诱导或抑制作用，从而起到抑制中性粒细胞在缺血区的聚集、黏附和浸润，从而减少缺血区域神经细胞的进一步坏死和凋亡，降低脑梗死体积。

[1]武海军,杨玉梅,何静波，等.扎冲十三味及其有效组分挥发油对大鼠脑缺血的保护作用[J].中药药理与临床,2012,28(5):190-192.

[2]田彩云,张浩楠,武海军,等.嘎日迪-13对局灶性脑缺血大鼠 NSE、TNF-α、IL-6 表达的影响[J].中草药,2015,46(5):716-720.

[3]Zea Longa EL, Weinstein RP, Carlon S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Williams AJ, Dave JR, Tortella FC. Neuroprotection with the proteasome inhibitor MLN519 in focal ischemic brain injury: relation to nuclear factor kappaB (NF-kappaB), inflammatory gene expression, and leukocyte infiltration[J].Neurochem Int, 2006, 49(2):106-112．

[5]Stanimirovic D, Satoh K. Inflammatory of cerebral endothelium: a role in ischemic brain inflammation[J].Brain Pathol,2000,10(1):113-126.

[6]Emerich DF, Dean RL, Bartus RT. The role of leukocytes following cerebral ischemia: pathogenic variable of bystander reaction to emerging infarct[J]. Exp Neurol, 2002, 173(1):168-181.

[7]王知秋,陈衔城,杨国源.小鼠局灶性脑缺血后ICAM-1、Mac-1和MPO活性的变化[J].复旦学报, 2003, 30(4):304-307.

[8]Barone FC, Hillegass LM, Price WJ.?Polymorphonuclear leukocyte infiltration into cerebral focal ischemic tissue: myeloperoxidase activity assay and histologic verification[J].Journal of Neuroscience Research, 1991, 29(3):336-345.

[9]Del GJ, Garcia JH.?Polymorphonuclear leukocyte adhension in cerebrovascular ischemia: Pathophysiologic implications of leukocyte-4 adhension[M].Oxford:Oxford University Press,1995,408-425.

[10]罗武生,郭兆贵.用髓过氧化物酶法定量测定心肌组织中的中性白细胞[J].中国药理学通报,1990, 6(4):264-266.

[11]张国红,王春霖,吕平. 大鼠局灶性脑缺血再灌注后不同时间E-选择素、P-选择素和细胞间粘附分子-1的表达[J].中国药理学通报, 2005, 21(10):1218-1223.

2016年9月27日收稿

Changes of myeloperoxidase after Cerebral Ischemia in Rats and Intervention of Mongolian Medicine Garidi-13

CAO Li-xia, HE Jing-bo, ZHENG Yan-ze, ZHANG Hao-nan, TIAN Cai-yun, WU Hai-jun, YANG Yu-mei

Institute of Cardiovascular, Bao Tou Medical Collage, Bao Tou 014040,China

Objective: To investigate the activity of myeloperoxidase (MPO) in brain tissue and serum at different phase after cerebral ischemic in rats as well as the effect of Mongolian Medicine Gridi-13 on them. Methods: A total of 360 male SD rats were selected. They were randomLy divided into sham-operated group, model group, Gridi-13 large dose group, Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group. Each group was randomLy divided into 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h and 120 h time phase group. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was established by modified Zea Longa thread-occlusion method and the activity of MPO in brain tissue and serum were analyzed by spectrophotometry. Results: Compared with the sham group, model group the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase was significantly increased (P<0. 05), has significant differences. Garidi-13 in each dose group could predominantly reduce the activity of MPO in brain tissue and serum at different phase, compared with model group has significant difference (P<0. 05). And the role of 24h is particularly evident (P<0.01). Conclusion: Gridi-13 could predominantly reduce the activity of MPO protect cerebral ischemia injury in rats, which may be related with alleviating neuronal damage, regulating inflammatory factors and relieving the injury of brain tissue to play a role of therapeutic action in cerebral ischemic injury.

Gridi-13; cerebral ischemic; MPO

国家自然科学基金项目，编号81160560

曹丽霞(1990-)，女，硕士在读，研究方向为中蒙药药理与心血管药理。Tel:18747274656 E-mail: 1550074087@qq.com

*通讯作者： 杨玉梅，女，教授，硕士生导师。E-mail: yym457@yahoo.com.cn

R291.2

A

1006-6810(2016)12-0029-04