七氟醚对大鼠急性肺损伤NF-кB活性的影响及肺保护作用△

傅艳妮　胡楚文　刘　玲　纪风涛（中山大学孙逸仙纪念医院　广州510120）



七氟醚对大鼠急性肺损伤NF-кB活性的影响及肺保护作用△

傅艳妮胡楚文刘玲纪风涛*（中山大学孙逸仙纪念医院广州510120）

摘要：目的：应用大鼠酸吸入急性肺损伤模型，在酸吸入损伤后早期吸入七氟醚，观察对大鼠急性肺损伤NF-кB活性的影响及肺保护作用。方法：随机将SD大鼠分为5组（n=16），生理盐水组：气管内注入生理盐水1mL/kg；盐酸吸入组：气管内注入pH=1.25盐酸溶液1mL/kg；七氟醚处理组：气管内注入盐酸溶液，并分为3个亚组（七氟醚0．5h组，七氟醚1h组，七氟醚2h组），分别在给予盐酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。于注入生理盐水或稀盐酸5h后处死各组大鼠，检测肺组织NF-кB活性及肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的浓度。结果：与生理盐水组比较，盐酸吸入组肺组织NF-кB/p65阳性细胞增多（P＜0.01），七氟醚处理1h与2h后阳性细胞较盐酸吸入组减少（P＜0．05）；盐酸吸入组肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的浓度较对照组增高（P＜0.01），七氟醚处理1h与2h后，与盐酸吸入组比较，TNF-a、IL-6的浓度降低（P＜0．05），IL-10的浓度无明显改变。结论：七氟醚对酸吸入急性肺损伤可起部分保护作用，其机制与抑制NF-кB在大鼠肺组织中激活有关。

关键词：七氟醚急性肺损伤NF-кB炎症反应

麻醉期间，酸性胃内容物反流误吸入肺是导致急性肺损伤的临床常见原因之一。七氟醚是临床最常用的含氟类挥发性吸入麻醉剂，挥发性麻醉药物对机体影响及作用机制的研究多集中于脑、心、肝脏等脏器，对肺的影响研究较少。有研究显示含氟类挥发性吸入麻醉剂对正常肺的影响并非有利[1]，但大量离体或整体动物实验证实，吸入七氟醚对心肌及脑缺血再灌注损伤有保护作用，可有效减少心肌和脑的梗死体积，减轻细胞损伤，抑制或延缓细胞凋亡、坏死[2]。核因子-кB（NF-κB）存在于肺内多种细胞中，NF-кB活化与肺部炎症反应密切相关。本研究拟应用大鼠酸吸入急性肺损伤模型，在酸吸入损伤后早期吸入七氟醚，观察对大鼠急性肺损伤NF-кB活性的影响及肺保护作用。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组：健康清洁级雄性SD大鼠80只，体质量220～250g（中山大学动物中心提供）。随机分为5组，每组16只。生理盐水组：气管内注入生理盐水1mL/kg；盐酸吸入组：气管内注入pH=1.25盐酸溶液1mL/kg；七氟醚处理组：气管内注入盐酸溶液，分为3个亚组（七氟醚0．5h组，七氟醚1h组，七氟醚2h组），分别在给予盐酸溶液1h后，吸入2．4%七氟醚0．5h、1h、2h。

1.2动物模型及七氟醚处理：各组大鼠腹腔注射戊巴比妥40mg/kg麻醉，颈部正中切口，显露并穿刺气管，滴注生理盐水1mL/kg或pH=1.25盐酸溶液1mL/kg。1h后将七氟醚组大鼠放入自制密封箱，两端各有一进气孔和出气孔，底部铺薄层钠石灰，进气口与装有七氟醚气体挥发罐的麻醉机（美国欧米达公司）连接，设定载入氧气浓度为40%，出气口接麻醉气体监测仪（美国欧米达公司），调整挥发罐和新鲜气流至出气口七氟醚（美国雅培制药有限公司）浓度为2．4%，大鼠自主呼吸，分别吸入七氟醚0.5h、1h、2h。

1.3样本制备：注入生理盐水或稀盐酸5h后，经颈动脉放血处死大鼠。快速开胸取出完整肺脏，结扎右支气管，取大鼠右肺下叶，10%中性甲醛固定后，石蜡包埋，4μm切片免疫组化染色。4℃生理盐水灌洗左肺，收集肺泡灌洗液，离心取上清液-80℃保存，ELISA法检测肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-10（IL-10）的浓度。

1.4结果判定：采用即用型超敏S-P免疫组化试剂盒（福州迈新公司）测定NF-кB的活性，抗p65单克隆抗体与NF-кB亚单位p65区域结合。正常情况下此结合区域被NF-кB抑制蛋白IкB覆盖，抗p65单克隆抗体不能与之结合，只有当IкB释放后，才能结合，故该抗体能够原位检测到NF-кB的活化。ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的浓度。

1.5统计学方法：应用SPSS13．0统计学软件进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，多组两两比较采用q检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实验动物一般情况：5组大鼠体重、雌雄分布无显著差异（P＞0．05）。大鼠在实验过程中无一死亡。

2.2肺组织NF-кB/p65阳性细胞率：与生理盐水组比较，盐酸吸入组及七氟醚处理组，肺组织NF-кB/p65阳性细胞明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与盐酸吸入组比较，七氟醚处理1h与2h阳性细胞明显减少（P＜0．05），七氟醚处理0.5h无明显差异（P＞0．05），见表1。

表1　各组大鼠肺组织NF-кB阳性细胞率比较（n）

2.3肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量：与生理盐水组比较，盐酸吸入组及七氟醚处理组，肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6 和IL-10的浓度明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与盐酸吸入组比较，七氟醚处理1h与2h TNF-a、IL-6的浓度明显降低（P＜0．05），七氟醚处理0.5h无明显差异（P＞0．05）；IL-10的浓度无明显改变，见表2。

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

表2　肺泡灌洗液中TNF-a、IL-6和IL-10的含量（pg/ml，n=16，±s）

△：与对照组比较：P＜0.01；▲：与盐酸吸入组比较P＜0.05。

生理盐水组　盐酸吸入组　七氟醚处理0.5h七氟醚处理1h七氟醚处理2h TNF-a 48.35±12.18 273.41±31.22△261.12±34.12△227.31±29.33△▲197.46±22.13△▲IL-6　 55.67±17.23 312.58±28.96△306.71±32.98△274.39±27.43△▲233.54±25.72△▲IL-10　 37.92±6.53　 219.64±19.25△207.24±26.41△199.75±23.37△　201.68±30.63△

3　讨论

七氟醚因对呼吸道刺激性小，不易引起气道痉挛，起效迅速，苏醒快，是临床最常用的含氟类挥发性吸入麻醉剂。肺是挥发性吸入麻醉药物首先直接作用部位，有研究显示，正常肺脏吸入1.5MAC七氟醚2h后，某些促炎性细胞因子基因表达增加，但肺脏湿/干重比没有明显改变，病理学变化轻微，没有出血、水肿及炎性细胞浸润[1]。但大量离体或整体动物实验提示，七氟醚对心肌及脑缺血再灌注损伤等有保护作用，可有效减少心肌和脑的梗死体积，减轻细胞损伤，抑制或延缓细胞凋亡坏死。

本实验于大鼠气道内注入盐酸溶液，模拟急性肺损伤模型，并于损伤早期吸入1MAC七氟醚，并维持不同时长。本研究结果显示急性肺损伤肺组织NF-кB/p65阳性细胞率较生理盐水组明显增高，七氟醚处理1h与2h后阳性细胞显著减少。NF-кB是一种重要的转录因子，通过调控参与炎症反应的细胞因子、炎症介质、粘附分子及蛋白酶类的基因转录在炎症反应中起重要作用。NF-κB存在于肺内中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等免疫反应细胞中。许多炎症介质如IL-1，IL-6，TNF-a，GM-CSF等都受NF-кB活化调控，与肺部炎症反应密切相关。激活的NF-кB可增强TNF-a、IL-6等众多细胞因子的转录，使炎症细胞合成炎症因子的时间缩短和数量增加[3]。因此，NF-KB是核内炎性递质基因转录的开关，阻断NF-кB活化，可减少炎症介质产生，减轻炎症介质对肺的损伤。

TNF-a是炎症反应和急性肺损伤过程中最早释放的细胞因子，主要由单核/巨噬细胞产生，为炎症反应中重要启动因子，并受NF-кB活化调控。IL-6由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等在摄取抗原抗体复合物后或在抗原呈递过程中产生。TNF-a和IL-6释放，激活炎性级联反应细胞因子、脂性递质及活性氧簇；还可上调细胞黏附分子，最终促使炎性细胞浸润到组织内[4]。

本实验中，急性肺损伤大鼠经七氟醚处理，肺泡灌洗液中TNF-a和IL-6浓度升高被抑制，提示七氟醚通过降低TNF-a 和IL-6浓度减轻肺部炎症反应。七氟醚处理组灌洗液中TNF-a 和IL-6浓度与对照组比较仍升高，表明七氟醚处理不能完全抑制炎症反应，但可起部分保护作用。IL-10是一种多功能炎症反应负性调节因子，能够参与免疫细胞、炎症细胞等多种细胞生物调节，主要作用是抑制促炎细胞因子释放[5]。本实验中我们观察到七氟醚处理后肺泡灌洗液中IL-10浓度无明显变化，可能与七氟醚发挥免疫调节作用使抗炎细胞因子与促炎细胞因子保持平衡有关。

综上所述，七氟醚虽不能完全抑制盐酸溶液所致急性肺损伤炎症反应，但可起部分保护作用，其机制可能与七氟醚抑制NF-кB在大鼠肺组织中激活，从而减少炎症介质释放，减轻炎症反应对肺损伤有关。

参考文献

[1]Kotain N，Hashimoto H，Sessler DI，et al．Expression of genes forproinflammatory cytokines in alveolar macrophages during propofol and isoflurane anesthesia．Anesth Analg，1999，89：1250-1256.

[2]Suter D，Spahn DR，Blumenthal S，et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesth Analg，2007，104（3）：638-645.

[3]Wissel H，Schulz C，Koehne P .Chlamydophila pneumoniae induces expression of Toll-like Receptor 4 and release of TNF-α and MIP-2 via an NF-κB pathway in rat typeⅡpneumocytes. Respir Res，2005，6:51.

[4]Sharma AK，Fernandez LG，Awad AS. Proinflammatory response of alveolar epithelial cells is enhaneed by alveolar macmphageproduced TNF-alpha during pulmonary ischemiareperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007，293:L105-113.

[5]Cavaillon Jm，Adrie C，Fitting C，et a1．Reprogramming of circulatory cells in sepsis and SIRS．J Endotoxin Res，2005，11（5）：311-320．

Effects of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats

Fu Yanni Hu Chuwen Liu Ling Ji Fengtao*（SunYat—Sen Memorial Hosital，SunYat—Sen University，Guangzhou 510120）

Abstract：Objective：To observe the effect of sevoflurane on hydrochloric acid aspiration induced acute lung injury in rats. Methods：80 rats were randomly divided into 5 groups（n=15）：NS group，HCL group，NS（1mL/kg）or HCL（1mL/kg）was instilled in rats airway．Sevoflurane groups（Sevo 0.5 h group，Sevo 1 h group，Sevo 2 h group）：One hour after HCL instillation，rats received 2.4%sevoflurane inhalation respectively for thirty minutes，one hour or two hours．Five hours after NS or HCL instillation，all groups were exsanguinated．The nurmber of NF-кB positive cells in lung tissue and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF were measured. Results：book=113,ebook=120Compared with the NS group，after HCL instillation，the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6，IL-10 in BALF significantly increased（P＜0．01）. Compared with the HCL group，in sevoflurane groups（Sevo 1 h group and Sevo 2 h group），the nurmber of NF-кB positive cells and the concentration of TNF-a，IL-6 in BALF decreased（P＜0．05）. Conclusion：Sevoflurane could attenuate lung inflammation in rats with hydrochloric acid induced acute lung injury，inhibit activity of NF-кB and possess potential protective effects．

Key words：Sevoflurane Acute lung injury NF-кB Inflammation

*通讯作者

基金项目：△广东省医学科学技术研究基金（A2013206）

中图分类号：R614

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）04-0112-03