大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑制作用及对质粒的消除作用△

黄轶凡张国华林亮君丘　敏（.中山市西区医院　中山　5840；.中山市小榄人民医院　中山　5845）



大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑制作用及对质粒的消除作用△

黄轶凡1张国华2林亮君1丘敏1（1.中山市西区医院中山528401；2.中山市小榄人民医院中山528415）

摘要：目的：探讨大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑制作用及对质粒的消除作用。方法：采用牛津杯法和逐个检出法分别检测大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和对质粒的消除作用。结果：大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用显著，MIC值为5ml/L，对ESBLs肺炎克雷伯菌作用24h和48h质粒的消除率分别为35.4%和55.2%。结论：大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌有显著抑制作用和质粒消除作用。

关键词：大叶桉质粒消除ESBLs肺炎克雷伯菌

近年来，随着抗生素大量应用，细菌的耐药问题逐渐变成全球性的问题。超广谱β-内酰胺类抗生素的不合理应用，导致细菌产生了由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），从而对β-内酰胺类抗生素耐药，其所含耐药基因可由质粒、整合子或转座子介导在不同菌种之间进行重排或转移，导致多重耐药[1]。据报道，我国不同地区14所医院临床分离菌中，克雷伯菌属产ESBLs的百分率平均为41.4%[2]，北京某医院的细菌监测报告显示，其院内产肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）产ESBLs率达56.1%[3]，受ESBLs肺炎克雷伯菌引发的肺部感染已成为临床治疗的一个难题。目前研究认为，ESBLs酶的产生耐药与耐药质粒的介导密切相关。因此，质粒消除或抑制是当前解决ESBLs耐药菌耐药性的研究热点。前期研究表明大叶桉精油具有良好的广谱抑菌作用[4，5]，本文进一步从大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌质粒的消除作用进行探讨，以期寻找可靠有效的ESBLs肺炎克雷伯菌质粒消除剂提供依据。

1　实验材料

1.1供试菌株：ESBLs肺炎克雷伯菌，为中山市中医院检验科微生物室临床分离菌株；质控肺炎克雷伯菌标准菌株（ATCC4352），购于南京便诊生物科技有限公司；实验操作在中山市中医院检验科微生物室完成。

1.2药物：大叶桉由广州至信药业有限公司提供，经鉴定为桃金娘科Eucalyptus robusta Smith的干燥叶。

1.3试剂与仪器：MH琼脂培养基（江门市凯林贸易有限公司）；无菌空白药敏试纸（OXOID）；吐温-80（广州化学试剂厂）；XSW-CJ-2A标准型净化工作台（吴江市津化设备总厂）；LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）；DL-ZD1浊度仪（珠海迪尔生物工程有限公司）；LMQR-4060型立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；针筒式滤膜过滤器（Millipore）。

2　实验方法

2.1 MRSA菌悬液的制备：ESBLs肺炎克雷伯菌经平板分离培养24h后，用无菌接种环挑取数个菌落置于生理盐水稀释液中，用浊度仪校正浓度至0.5麦氏标准液。

2.2大叶桉精油制备：大叶桉剪碎后用水蒸气蒸馏法固液比1:6提取挥发油，无水硫酸钠干燥备用。

2.3大叶桉精油抑菌活性实验[6]：大叶桉精油用1%的吐温80无菌水溶液（针筒式滤膜过滤器过滤除菌）稀释成150.00、100.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L的大叶桉精油稀释液，用微量移液器吸取30μL各浓度大叶桉精油均匀涂布于无菌空白药敏纸片，两面各15μL。纸片吸透药液后贴于接种了ESBLs肺炎克雷伯菌MH平板上，做好标记，置于37℃恒温培养箱中培养24h。以平板中贴浸30μL有1%吐温-80无菌水液（针筒式滤膜过滤器过滤除菌）的纸片为空白对照。用游标卡尺测量各组抑菌圈直径，每组实验重复3次，结果取平均值。

判断标准：不敏感（≤6.25mm，—），低度敏感（≤7mm，+），中度敏感（＞7mm，++），高度敏感（≥15mm，+++）。

抑菌率计算公式：抑菌率（%）=[（药液抑菌圈平均直径—空白纸片直径）/空白纸片直径]×100%。

2.4大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的测定[7]：用1%的吐温80水溶液稀成150.00、100.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L大叶桉挥发油稀释液。用医用无菌棉签蘸取0.1%的ESBLs肺炎克雷伯菌悬液接种于MH（Mueller-Hinton Agar）琼脂平板中，用无菌棉签涂匀后，移取0.2mL各浓度挥发油稀释液加于接种了MRSA菌的MH平板中，用无菌棉签均匀涂布，倒置于恒温培养箱中培养24h。观察ESBLs肺炎克雷伯菌生长情况，有菌落生长为阳性（+），未见菌落生长为阴性（-），以不生长ESBLs肺炎克雷伯菌菌落的精油最低浓度为大叶桉精油的MIC值。实验以1%的吐温80无菌水溶液作对照，重复3次，记录结果。

2.5庆大霉素和红霉素对ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC测定：将庆大霉素（Gm）和红霉素（Em）用倍比稀释法分别配制成128、256、512和1024μg/mL，MIC测定方法同“2.4”[7]。

2.6大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的质粒消除作用

2.6.1抗生素选择培养基的制备：将1/2 MIC浓度的庆大霉素和红霉素分别加入LB培养基，配制成质粒消除的选择性培养基，现用现配。

2.6.2质粒消除实验：用无菌棉签蘸取0.1%的ESBLs肺炎克雷伯菌悬液接种于MH平板中，用无菌棉签涂匀后，移取0.2mL小于MIC值浓度的大叶桉精油稀释液加于接种了ESBLs肺炎克雷伯菌的MH平板中，用无菌棉签均匀涂布，倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。选取菌落数在200～300个的平板，采用逐个检出法分别接种在配制好的选择培养基上和普通培养基平板上。37℃下培养24h和48h，观察平板上的菌落数量并记录结果。以不加药液的培养基作空白对照，以SDS（十二烷基硫酸钠）作为阳性对照组，每组重复3次，取其平均值[7]。

2.6.3质粒消除的结果判定：在不含抗生素的平板上生长而在含抗生素的选择平板上不生长，即为质粒消除子（需在选择培养基平板上进行复试确认）[7]。

质粒消除率（%）=A/B×100%

A：在不含抗生素的普通培养基平板上生长而在含抗生素的选择性培养基平板上不生长的菌落数；B：在不含抗生素的普通培养基平板上生长的菌落数。

2.7统计学方法：采用SPSS19.0软件进行X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3　实验结果与分析

3.1大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影响：大叶桉精油稀释浓度≥40mL/L对ESBLs肺炎克雷伯菌呈高度敏感性，抑菌圈在15mm以上，抑菌率均大于140%；大叶桉精油稀释浓度5～20mL/L对ESBLs肺炎克雷伯菌呈中度敏感性，抑菌圈在8.33～10.93mm，抑菌率在33.28%～74.88%；大叶桉精油稀释浓度低于5mL/L对ESBLs肺炎克雷伯菌呈低度敏感性，抑菌圈小于8.33mm，抑菌率小于33.28%，详见表1。

表1　大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影响结果

3.2大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的测定：大叶桉精油浓度≥5ml/L培养皿均未见ESBLs肺炎克雷伯菌生长，故大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC为5mL/L，详见表2。

表2　大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌MIC测定结果

3.3两种抗生素对ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的测定结果：庆大霉素和红霉素在1024mg/mL浓度以上的培养皿均未见ESBLs肺炎克雷伯菌生长，故庆大霉素和红霉素对ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC值均大于1024mg/mL，该剂量下可用于质粒消除实验，详见表3。

表3　两种抗生素对ESBLs肺炎克雷伯菌MIC的测定结果

3.4大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的质粒消除的结果：大叶桉精油作用于ESBLs肺炎克雷伯菌24h和48h质粒的消除率分别为35.4%和55.2%，表现出较好的质粒消除作用，其消除效果跟时间呈相关性，作用时间延长对质粒消除效果越好，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表4。

表4　大叶桉精油作用24h对ESBLs肺炎克雷伯菌质粒的消除率

4　讨论

现代研究表明，高温培养、溴化乙啶、紫外照射及SDS（十二烷基硫酸钠）均具有良好的R质粒消除作用，但这些方法要么毒副作用强，要么操作性差，较难在临床应用[8]。中草药中清热解毒的药物大部分具有较好的抗菌作用，而从中发掘天然无毒高效的质粒消除剂是当前的热点。已有研究发现黄连、紫花地丁、艾叶等对大肠埃希菌质粒具有消除作用[9]，黄柏和甘草对MRSA菌质粒也有消除作用，作用48h质粒消除率近30%[7]。组方清肺汤对耐药质粒的消除率为45%，与西药联用对肺炎克雷伯菌R质粒的消除率为37.5%，有助于恢复和增强耐药菌株对抗生素的敏感性[10]。大叶桉是南方经济树种，植株高大，从中提取出来的大叶桉精油含量高，具有很好的研究开发价值。研究发现，大叶桉精油在抗炎、抗菌、抗氧化等方面均有较好的药理作用[11]。本文采用牛津杯法和逐个检出法分别检测大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和对质粒的消除作用，结果显示大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌具有较好的抑制作用，其MIC为5mL/L，作用24h和48h对ESBLs肺炎克雷伯菌质粒的消除率分别为35.4%和55.2%，并随时间延长质粒消除作用增强，是较理想的质粒消除剂，具有研究开发价值。

参考文献

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Inhibition and plasmid elimination effect of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella pneumoniae

Hunag Yifan1Zhang Guohua2Lin Liangjun1Qiu Min1（1.Western Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528401，China；2.Xiaolan People’s Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528415，China）

Abstract：Objective：To study the inhibition and plasmid elimination of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella pneumoniae（KPN）. Methods：The inhibition and plasmid elimination of volatile oil in ESBLs KPN were determined by Oxford cup and one-by-one detection methods, respectively. Results：The growth of ESBLs KPN was obviously inhibited by volatile oil, with the MIC of 5 mL/L. The plasmid elimination rates were 35.4% at 24 h and 55.2% at 48 h.Conclusion：The volatile oil of Eucalyptus robusta possesses the significant inhibition and plasmid elimination on ESBLs KPN.

Key words:Eucalyptus robusta Plasmid elimination ESBLs klebsiella pneumonia

基金项目：△中山市卫生局医学科研立项（2015A020418）

中图分类号：R563.1

文献标识码：B

文章编号：1672-8351（2016）04-0109-02