欧矢车菊根不同极性萃取部位体外抗氧化活性及其总黄酮的微乳薄层研究

夏提古丽·塔西买买提，胡曙晨，热娜·卡斯木(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830011)



欧矢车菊根不同极性萃取部位体外抗氧化活性及其总黄酮的微乳薄层研究

夏提古丽·塔西买买提，胡曙晨，热娜·卡斯木
(新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011)

摘要:目的研究欧矢车菊(Centaurea Behen L．)根不同极性萃取物的体外抗氧化活性，并通过紫外分光光度法测量其中总黄酮含量，建立了欧矢车菊根总黄酮的最佳微乳薄层条件。方法采用1，1-二苯代苦味酰基(DPPH)自由基清除法、清除超氧阴离子自由基法、ABTS自由基清除法和铁离子还原能力测定法，测定欧矢车菊根不同极性萃取物的体外抗氧化活性，并与阳性对照进行比较与评价。同时采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，测定有效部位的总黄酮含量;以十二烷基硫酸钠(SDS)、正丁醇、正庚烷，水微乳液等作为展开剂，通过聚酰胺薄层层析，定性分析欧矢车菊根药材中总黄酮类成分，应用均匀设计，以色谱分离函数COF为统计指标，考察了微乳配比因素对分离效果的影响。结果不同极性萃取部位对DPPH和ABTS自由基均有清除能力并呈明显的量效关系，其中乙酸乙酯部位的清除能力最强，接近于对照品维生素C;欧矢车菊根不同极性部位都对超氧阴离子具有较弱的除能力;以上不同极性萃取部位均有Fe(3+)还原能力，除乙酸乙酯部位，其余4个部位的还原能力没有太大差异，当浓度达1 mg/mL时，乙酸乙酯萃取部位的还原能力接近于同浓度下维生素C的还原能力。结论欧矢车菊根药材不同极性萃取部位均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位抗氧化能力最显著，而且乙酸乙酯部位中总黄酮含量为最高。筛选出十二烷基硫酸钠(SDS):正丁醇=33:57，含水量75%(O/W型)微乳液为适宜的展开剂。本研究为欧矢车菊根有效成分的深入研究提供理论依据。

关键词:欧矢车菊根;抗氧化活性;自由基;微乳薄层层析

In vitro antioxidant activity of different polar extracts from Centaurea Behen L．and m icroemulsion thin-layer chromatographyof its general flavonoids

Xiatiguli Taximaimaiti，HU Shuchen，Rena Kasimu
(School of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

Abstarct:ObjectiveTo investigate the in vitro anti-oxidant activity of different polar extracts from Centaurea Behen L．，and determine the content of its total flavonoids and establish its microemulsion method．M ethods Using the 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging，superoxide radical-scavenging，ABTS plus radical scavenging and reducing reaction to determine and evaluate the anti-oxidant activity of different polar extracts from Centaurea Behen L．by comparing with positive control Vitamin C(VC)．Meanwhile，the content of flavonoidswas determined with Ultra-Visible spectrophotometry，using rutin as a reference substance;use lauryl sodium sulfate(SDS)，n-butyl alcohol，n-heptane，and watermicroemulsion as developing agent，through the poly-amide thin layer chromatography，qualitatively detected the constitutes of the total flavonoids from Centaurea Behen L．，and applied uniform design，made chromatographic seperation COF as a function of statistical indicator to investigate themicoemulsion ratio on the seperation effect．Results Different polar extracts from Centaurea Behen L．had scavenging activity on DPPH and ABTS plus free radical with obvious dose-effect relationship，in which the ethyl acetate extract had the besteffect，closing to the scavenging ability of the same concentration of VC;the scavenging activity of each parts for superoxide radicalwere nearly same to each other and weaker than VC;every parts showed Fe3+reduction activity，in which the reduction ability of other partswere notmuch different beside the ethyl acetate part，ie，the reduction ability of 1mg/mLethyl acetate partwas closed to that of VC．Conclusion The different extracts from Centaurea Behen L．possessed certain anti-oxidant activity，among which the ethyl acetate part possessed themost significant activity，and the general flavonoids content of this partwas the highest．After screening，lauryl sodium sulfate(SDS):n-butyl alcohol=33:57，75%water content(O/W type)microemulsion were the suitabler developing solvent．which will be benefit for deep research of active ingredients from Centaurea Behen L．．

Key words:Centaurea Behen L．;anti-oxidant activity;free radical;microemulsion thin-layer chromatography

欧矢车菊根是菊科矢车菊属(Centaurea)植物欧矢车菊(Centaurea behen L．)的干燥根和根茎。欧矢车菊为多年生草本植物，维吾尔医常用其干燥根及根茎作为药材。维吾尔语名阿克拜赫曼，《中华本草》、《拜地依药书》、《药物之园》载:“本品名为‘拜赫曼’植物的干燥木质根的碎块，该根又分红白2种，即红者称‘拜赫曼苏肉赫’，白者称‘拜赫曼赛菲德’”［1－3］。在《维吾尔医常用生药》［4］中记载:“欧矢车菊根对心脏衰弱有较好的疗效，并粉末里加盐和蜂蜜后涂在脸上，可以美容。使用其煮的水洗头发，可以让头发变得更滋润”。欧矢车菊主要分布于高加索东部和南部、土库曼斯坦山区、亚美尼亚、库尔德斯坦及西亚各地。据研究报道，矢车菊属植物有较好的抗氧化活性［5］，现代药理研究表明，黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等功效［6－11］。矢车菊属类药材含有多种的黄酮类化合物［12－13］，但目前为止未见对欧矢车菊根药材中黄酮类成分研究，对其药材抗氧化活性的报道尚无。本试验采用紫外分光光度法［14－19］测定欧矢车菊根不同萃取部位中总黄酮的含量和抗氧化活性，为欧矢车菊有效部位的研究与深度开发提供科学依据。

1　仪器与试药

1．1仪器UV-2550型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司);AB135-S型分析天平(美国Mettler Toldo公司);KQ-250DE型超声波清洗器(上海科导);TDL-5A型离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);HH-S4型恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂); Linomat 5卡玛型半自动点样机(瑞士卡玛公司); Linomat 5卡玛型半自动扫描机(瑞士卡玛公司);微量进样针(上海安亭微量进样器厂);聚酰胺薄层板(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。

1．2试药欧矢车菊根(Centaurea Behen L．)由新疆安萨尔维吾尔药业有限公司提供，原产地为巴基斯坦。1，1-二苯代苦味酰基(美国Sigma公司，批号:S43654-357)，邻苯三酚(天津永晟精细化工有限公司，批号:20120517)，Tris-HCI(美国Sigma公司)，磷酸二氢钠(天津市化学试剂六厂分厂，批号: 20121102)，磷酸氢二钠(天津市福晨化学试剂厂，批号:20060314)，铁氰化钾(天津市天达净化材料精细化工厂，批号:20130906)，三氯乙酸(天津永晟精细化工有限公司，批号:20140101)，三氯化铁(天津市化学试剂三厂，批号:20111008)，十二烷基硫酸钠(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号: 20110202)正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号:20130513)，正庚烷(天津市富宇精细化工有限公司，批号:20110408)，甲醇、95%乙醇为分析纯，水为蒸馏水。

2　方法与结果

2．1欧矢车菊根浸膏以及不同萃取部位的制备

取欧矢车菊根药材1．5 kg，分别加5、4、4、4倍量的95%乙醇加热回流提取4次，每次3、2、2、2 h，合并提取液，浓缩至无乙醇味，浸膏在蒸馏水中溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别将各溶剂萃取液浓缩，蒸干，备用。

2．2抗氧化试验

2．2．1供试液制备分别精密量取适量水、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚部位浸膏，用甲醇溶解并定容至系列浓度(0．1～0．5 mg/mL)。

2．2．2阳性对照溶液的制备精密称取维生素C对照品25 mg于25 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容。用水稀释成浓度分别为0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mg/mL，备用。

2．2．3欧矢车菊根不同极性萃取部位对DPPH的清除作用精密量取0．04 mmol/L的DPPH溶液4 mL和2 mL样品溶液混合，在30℃水浴中30 min反应后在516 nm波长处测吸光度(C);4 mLDPPH与2 mL试样溶剂混合后的吸光度(A);2 mL样品与4 mL甲醇混合液的吸光度(B)。结果表明欧矢车菊根不同萃取部位对DPPH自由基均有清除能力，并呈明显的量效关系。随着浓度的增加，各萃取部位清除DPPH的能力也不断增强，其中乙酸乙酯部位表现了较强的自由基清除能力，并在试验浓度范围内，与Vc的清除能力相近，抗氧化活性能力依次为:Vc＞乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞氯仿部位＞水部位＞石油醚部位，见图1。

图1　欧矢车菊根各萃取部位对DPPH自由基的清除能力

2．2．4欧矢车菊根不同极性萃取部位对ABTS自由基的清除作用精密量取7 mmol/L的ABTS溶液和2．45mmol/L的过硫酸钾溶液混合放置16 h产生ABTS自由基，在测定前用75%乙醇稀释，使它在734 nm处吸光度为(0．700±0．020)。分别取不同浓度的不同极性萃取部位样品溶液，用75%乙醇稀释至100 mL(相当于原组分0．315 mg/mL)，加ABTS浓液3 mL，混匀，避光静止10 min，立即在734 nm处测吸光度并计算其清除率。结果显示欧矢车菊根各部位均对ABTS自由基具有一定的清除作用，其IC50分别为:Vc(1．6μg/mL);水部位(0．21 mg/ mL);正丁醇部位(0．01 mg/mL);乙酸乙酯部位(0．004 mg/mL);石油醚部位(0．04 mg/mL)。按IC50值，清除ABTS自由其的能力强弱依次为:Vc＞乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞水部位＞石油醚部位，见图2。

图2　欧矢车菊根各萃取部位对ABTS自由基的清除能力

图3　欧矢车菊根各萃取部位清除超氧阴离子自由基(·)的能力

2．2．6欧矢车菊根不同萃取部位对铁离子的还原能力精密量取不同极性萃取部位样品溶液2．5 m L于20 m L具塞试管中，依次加入2．5 m L磷酸缓冲液(0．2 moL/L，pH=6．6)，2．5 m L铁氰化钾(1%，w/v)，混匀，于50℃水浴中20 min，加入2．5 m L三氯乙酸(10%，w/v)，混匀，以3 000 r/min离心10 min，取上清液2．5 m L，加入2．5 m L蒸馏水和0．1%的三氯化铁溶液0．5 m L，混匀，以试剂空白做参比，在700 nm处测定吸光值。通过对吸光度与浓度的曲线作线性回归，计算吸光度为0．5时的样品溶液的浓度IC50，欧矢车菊根药材不同萃取部位对铁离子均有还原能力，但均弱于Vc，除中乙酸乙酯部位的还原能力较强外，剩下部位的还原能力无明显差别，见图4。

2．3欧矢车菊根药材不同极性萃取部位中总黄酮含量测定

2．3．1对照溶液的制备精密称取芦丁对照品5．04 mg，置25 mL容量瓶中，加适量95%乙醇，超声溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。

图4　欧矢车菊根各萃取部位还原Fe2+铁离子的能力

2．3．2供试品溶液的制备精密称取水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位、氯仿部位、石油醚部位分别为4．73、5．10、4．90、4．82、4．70 mg，置25 mL容量瓶中，加适量95%乙醇，超声溶解并稀释至刻度，作为供试液。

2．3．3标准曲线的制备精密吸取对照溶液0．1、0．2、0．5、0．8、1．0、1．2、1．5 mL，分别置于7支10 mL的容量瓶中，并以95%乙醇稀释至刻度。在260 nm波长处以1 mL95%乙醇用蒸馏水稀释至10 mL的空白试剂作参比测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，芦丁浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=0．029 1C-0．016 2(r2=0．999 0)，芦丁浓度在2．02～30．30 mg/mL与吸光度线性关系良好。2．3．4样品中总黄酮含量测定精密吸取“2．3．2”项下各溶液1．0 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，于260 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮含量，见表1。

2．4欧矢车菊根黄酮类成分微乳薄层研究

2．4．1样品处理方法取粉碎的欧矢车菊根药材约4 g，加10 mL甲醇，置于具塞三角瓶，超声提取30 min，过滤，滤液备用。

2．4．2微乳液展开剂的配制在保证十二烷基硫酸钠(SDS)-正丁醇-正庚烷-水为质量比的条件下，改变含水量，配制系列微乳液。分别按上述质量比称取SDS、正丁醇、正庚烷，水搅拌溶解，混匀，放置24 h。将微乳液与有机溶剂按一定的比例混合，振摇2～3 min至溶液澄清透明备用，各种微乳液的成分配比及结构见均匀设计。

表1　欧矢车菊根药材各部位总黄酮含量(%，n=3)

2．4．3点样及展开条件用微量进样针吸取供试品溶液，用点样机在聚酰胺薄膜上点样，条带宽度为5 mm，点样量3μL，聚酰胺薄层板放入有15 mL展开剂的展开缸里，展开方向为单向上行法，展开前饱和10min，自展开剂上至斑点处时开始计时，待展开达8 cm左右展开结束，环境温度25℃。

2．4．4显色剂于室温下展开，取出晾干，均匀喷洒1%乙醇胺二苯硼酸酯甲醇溶液，然后均匀喷洒5%聚乙二醇乙醇溶液，晾干，置366 nm紫外灯下检视。

2．4．5目标函数的建立根据本实验的所要到达的分离效果，建立薄层分离目标函数，其中Ai，B，C分别为各项的权重系数;N为每次实验分离出的斑点数，k=N－1为相邻斑点对数，N1为第一次实验分离出的斑点数;Rsi，i+1为分离度，Rsi，i+1=1．177 (Li+1－Li)/(W1/2i+1+W1/2i)，Li和Li+1为第i个和第i+1个斑点移动距离;W1/2为半峰宽;Rsi，i +1d=1．177，为理想分离度;0．2≤Rf≤0．8时，Dj (Rf)=0;Rf＞0．8时，Dj(Rf)=(0．8－Rf)/0．8;Rf＜0．2时，Dj(Rf)=(Rf－0．2)/0．2;Dj(Rf)为自定义函数。它的物理意义是:相邻斑点的分离度越大，则COF值越小;距最佳范围最近或落在最佳范围内的斑点越多，则COF值越小;斑点总数越多，则COF值越小。此改良式考虑了色谱峰的分离度、Rf值范围以及斑点数3方面因素，能全面评价所得色谱图的质量，并且具有较好的灵活性，因而以COF作为寻优的目标函数是非常合适的。

2．4．6单因素考察

2．4．6．1十二烷基硫酸钠与正丁醇比例对展开的影响考察SDS-正丁醇-正庚烷比例:20:70:10、25: 75:10、30:60:10、35:65:10、40:50:10、45:55:10。结果SDS-正丁醇的比例在30:60～40:50之间。

2．4．6．2甲酸加入与否对展开效果的影响加入甲酸后，展开时间缩短。斑点分离度改善，Rf范围增加，斑点面积增大，亮度降低。甲酸的加入弱化了SDS-正丁醇比例对于展开效果的影响，斑点数下降。

2．4．6．3含水量对展开效果的影响考察含水量: 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%，随着含水量的增加，斑点的扩散程度增加，比移值范围加宽。结果含水量在60%～75%较为合适。

2．4．6．4正庚烷比例对展开效果的影响考察正庚烷比例:7．5%、10%、12．5%、15%对于展开效果的影响，结果显示正庚烷比例在7．5%～15%对展开效果没有明显影响，故采用最常用的10%。

2．4．6．5改性剂类型对展开效果的影响考察甲酸、乙酸、乙醇、冰醋酸、丙酮对于展开效果的影响，结果甲酸和乙酸效果相当，乙醇和丙酮效果不好，最终不加改性剂。

通过单因素考察，确定微乳薄层的展开剂为十二烷基硫酸钠-正丁醇的比例在30∶60～40∶50之间，含水量60%～75%，不加改性剂。

2．4．7均匀设计1以十二烷基硫酸钠(SDS)、正丁醇、正庚烷，水微乳液等作为展开剂，考察了微乳配比因素对分离效果的影响，不同展开剂配比及薄层展开效果见表2、图6。经过统计软件DPS7．50进行二次多项式回归计算，计算结果P=0．008 6，最佳组合X1=0．448 5，X2=0．75。

表2　均匀设计1以及在不同配比下的展开剂COF值

图6　均匀设计1在366 nm处的展开薄层图

2．4．8均匀设计2由于均匀设计1中，含水量75%时，十二烷基硫酸钠∶正丁醇的比例对展开剂影响较大，缩小范围在进行一次均匀设计和计算。均匀设计2详细结果见表3，样品在不同展开剂中展开的结果在366 nm处观察到的现象，见图7。经过统计软件DPS7．50进行二次多项式回归计算，计算结果P=0．041 1，最佳组合:X1=0．578 4，X2= 0．745 9。由图7可见，欧矢车菊根药材中的黄酮类成分能被微乳薄层完全分离，最佳展开条件为:十二烷基硫酸钠∶正丁醇∶正庚烷=33∶57∶10(质量比)，含水量75%的微乳液展开剂。

表3　均匀设计2以及在不同配比下的展开剂COF值

图7　均匀设计2在366 nm处的薄层展开图

3　讨论

本研究采用DPPH法、ABTS自由基清除法、超氧阴离子法和还原能力法对欧矢车菊根不同极性萃取部位的抗氧化活性进行综合性评价。结果在4个不同抗氧化活性评价模型中，欧矢车菊根不同极性萃取部位都呈现出不同程度的活性，其中对DPPH的清除作用最强。在欧矢车菊根不同极性萃取部位中，乙酸乙酯萃取部位呈现出较强的抗氧化活性，其余部位的活性差异不大。乙酸乙酯萃取物在较高浓度时，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力以及对铁离子还原能力较强，可接近于对照品Vc 对DPPH的清除能力和还原能力。因此，欧矢车菊根的抗氧化有效部位大多集中在乙酸乙酯萃取部位中，通过测定各萃取部位总黄酮含量，抗氧化有效成分大多是易溶于乙酸乙酯的中等级性黄酮类化合物。对黄酮类化合物进行微乳薄层研究，与常用薄层方法比较，微乳薄层操作简便，分离效率高，荧光强度增大，色谱斑点集中，检出灵敏度高的特点，为分离欧矢车菊根抗氧化有效成分研究奠定了基础。

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［2015-12-6］

(本文编辑施洋)

·民族肿瘤学·

通信作者:热娜·卡斯木，女(维吾尔族)，博士，教授，博士生导师，研究方向:新疆特色中药资源的开发与利用研究，E-mail:renakasimu@vip．sina．com。

作者简介:夏提古丽·塔西买买提(1990－)，女(维吾尔族)，在读硕士，研究方向:新疆特色中药资源的开发与利用。

基金项目:新疆维吾尔自治区十二五重大专项(201130105－2)

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．005

中图分类号:R914

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0277-06