大鼠面神经损伤修复晚期面神经核的基因表达谱

陈沛，宋俊，李春丽，张鄂，罗凌惠，肖红俊，龚树生

大鼠面神经损伤修复晚期面神经核的基因表达谱

陈沛1，宋俊2，李春丽1，张鄂1，罗凌惠3，肖红俊3，龚树生4

目的：筛选外周损伤修复晚期面神经核区的差异表达基因。方法：建立大鼠面神经断伤吻合模型，90 d后准确解剖定位获取健患两侧面神经核组织的总RNA，再以其逆转录的cDNA为模板转录生成生物素标记的cRNA，纯化与片段化后形成探针并与大鼠基因表达谱芯片杂交，扫描仪检测信号后用生物学分析软件筛选差异表达基因并作初步功能分析。结果：基因芯片检测表明，患侧面神经核区检出1 660个基因，健侧检出1 683个基因，与健侧相比筛选出差异基因300个，其中上调157个（差异倍数≥2），下调143个（差异倍数≤-2）。GO分析电子功能注释发现，差异基因功能涉及代谢反应、细胞黏附、细胞因子、信号传递等。KEGG信号通路分析筛选出最可能相关的信号通路32个（P＜0.05），包括白细胞跨膜转运、黏着斑激酶途径等。结论：基因表达谱分析表明多基因、多信号通路参与外周损伤修复晚期面神经核内的塑形活动。

损伤修复；面神经核；基因芯片

外伤、手术、炎症或肿瘤均可引起面神经损伤而导致面瘫，修复治疗后也常伴发鳄鱼泪、联带运动、面肌痉挛等面瘫后遗症，所造成的容貌损害及功能障碍严重影响患者的生活、工作、社交与心理健康。面运动神经元接受、传导和整合运动信息，决定着面神经损伤后的变性过程与再生质量[1,2]。研究表明，外周损伤后面运动神经元周围的突触传入、神经递质调控、免疫反应与胶质活动均发生塑形改变[3-6]。虽然一系列与神经元轴突再生相关的基因被研究发现[7-11]，但面神经核内的伤后复杂的塑形活动涉及多个途径、多基因改变，目前的研究却多着眼于外周损伤后一些基因的短期变化，缺乏对损伤修复晚期面神经核内基因表达谱变化的全面分析。基因芯片将传统分子生物学方法与芯片技术结合，可在较短时间内对大量基因进行检测，故可对较复杂、多因素的病理生理过程导致的大量基因表达异常进行分析，为研究者提供一个较全面、无偏倚的判断[12,13]。

研究发现，大鼠面神经断伤修复2月后，无论行为学与肌电活动均检测到联带运动[14]。因此，本研究建立大鼠面神经断伤吻合模型，获取伤后晚期健患两侧的面神经核组织，应用基因芯片技术筛选出差异表达基因，通过分子生物学数据分析，寻找可能与神经再生修复和后遗症产生有关的信号分子及信号路径，为进行相关深入研究提供有价值的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD雌性成年大鼠6只，体质量200～220 g。

1.1.2 主要试剂与仪器 Leica VT1200振动切片机（购于德国Leica公司）。Rat Genome 230 2.0 Array基因表达谱芯片（购于美国Affymetrix公司）；在线分子注释系统（Molecule Annotation System，MAS 2.0，购于北京博奥生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 取6只大鼠，常规10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后于无菌条件下暴露左侧茎乳孔外面神经主干，斜行切断后用11-0无创缝线断端缝合神经外膜两针，逐层缝合肌肉皮肤，同法处理右侧，但仅暴露面神经主干。麻醉苏醒后，观察到大鼠左侧触须失去拂动能力，鼻尖偏向健侧，眼睑下垂，同时左侧触须出现细微纤颤，常伴嗤鼻动作，提示面瘫模型建立成功[6,14]。

1.2.2 面神经核组织RNA获取 大鼠饲养至术后90 d时，麻醉后断颈取脑并迅速于冰上切取脑干组织，行振动切片机切片，层厚100 μmol/L，至接近脑干腹侧出面神经根处时脑片行1%甲苯胺蓝快速染色1 min，显微镜下观察确认为含面神经根层面后，调整片厚为500 μmol/L，切1片弃去后留取第2片脑片待用，重新调整片厚至100 μmol/L，待切取脑片行快速甲苯胺蓝染色确认所获取的500 μmol/L脑片为含面神经核团组织后，在该脑片上切取距中线1.5 mm、距腹侧水平线1 mm面核区内约1.5×1.5 mm大小组织；同法取健侧面神经核组织。利用Trizol试剂盒采用一步法分别提取实验组与对照组面核脑组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA质量，1%琼脂糖电泳鉴定总RNA完整性。

1.2.3 芯片检测、数据处理和生物学信息分析 以RNA为模版，逆转录依次合成单链及双链cDNA，双链cDNA经纯化后体外转录合成生物素标记的cRNA，纯化后再片段化形成探针。配制好基因芯片杂交液，将杂交液置于加热块上，99℃温育5 min，预杂交后，将芯片平衡放置于杂交炉中，45℃下60 rpm旋转杂交16 h。应用Affymetrix公司流式工作站450和扫描仪3 000进行芯片清洗染色和扫描。

用Gcos1.4软件进行单张芯片信号值提取，和dChip 2006软件中的不变集（invariant 8et）标准化方法对6张芯片的数据进行归一化处理，按差异表达水平达2倍为显著性标准筛选出表达差异的基因，利用在线分子注释系统，对差异基因进行基因功能的分类注释（gene ontology，GO）和信号通路分析（KEGG）。

2 结果

2.1 获取面神经核组织RNA

依据大鼠脑立体定位图谱，在振动切片机切取含面神经根层面100 μmol/L脑片后（图1A-C），切取第2片500 μmol/L厚内含面神经核组织的脑片，核团定位准确性由随后所切取的100 μmol/L脑片快速甲苯胺蓝染色证实（图1D-F，图1E内方框示具体取材部位)。健侧面核区组织中提取总RNA为（18.5±1.6）µg，患侧面核区组织中提取总RNA为（21.8±2.1）µg，健患两侧RNA的OD260/OD280比值在1.95～2.10之间。RNA样品电泳条带清晰，28S∶18S rRNA条带亮度接近1∶1（图2），RNA质量符合表达谱芯片实验要求。

2.2 基因芯片检测结果

基因芯片提供的2 800个基因中，患侧检出1 660个，健侧检出1 683个。按差异表达水平达2倍为显著性标准，与健侧芯片数据比较筛选出差异基因300个，其中上调157个（差异倍数≥2），下调143个（差异倍数≤-2）。GO分析电子功能注释表明，表达上调基因功能涉及代谢反应、细胞黏附、细胞因子、信号传递等；表达下调基因功能涉及细胞因子、代谢、细胞粘附、信号传递等生物学过程（表1）。

对差异表达的基因进行KEGG信号通路分析，筛选出最可能相关的信号通路32个（P＜0.05），包括白细胞跨膜转运、铁离子通道结合、细胞因子活动、细胞粘附分子、损伤反应、磷脂酰信号系统、骨架分子活动、局部粘着、生物刺激反应等。其中表达上调的差异基因RGD1565941_predicted、绒毛蛋白2、claudin 1先后6次参与白细胞跨膜转运途径，另外3个表达上调的差异基因整合素β6、Pip5kia、类VAV3致癌基因则同时参与黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）途径信号通路。

图1 大鼠含面神经根（A-C）与面神经核脑片层面（D-F）

图2 健患两侧面神经核组织RNA电泳图

3 讨论

本研究提取大鼠健患两侧面神经核区组织总RNA进行基因芯片检测，所获取的总RNA经紫外分光光度计和琼脂凝胶电泳进行质检证实合格。由此可见，根据大鼠脑立体定位图谱解剖知识，采用振动切片结合快速甲苯胺蓝尼染色方法，可以快速、准确地定位面神经核区脑组织，从而获得质量可靠的RNA用于下游检测，为本领域及其它脑研究提供了技术参考。

本研究选用包含3 100个探针位点、代表2 800个功能明确的大鼠基因的cDNA基因表达谱芯片，经检测，得到外周损伤修复晚期大鼠面神经核内较全面的基因表达变化信息，有助于推测该差异基因群与神经损伤修复晚期塑形活动与后遗症产生的可能联系。利用MAS2.0系统分析发现，差异基因功能涉及白细胞跨膜转运、铁离子通道结合、细胞因子活动、细胞粘附分子、损伤反应、磷脂酰信号系统、骨架分子活动、局部粘着、生物刺激反应等，其中大部分尚未见涉及神经损伤的详细报道。

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）通过和细胞膜上的特异性受体结合，促进细胞生长、分化、调亡及诱发炎症等多种生物学效应，活跃地参与神经损伤修复活动[15]。TNF超家族2的表达产物TNF-α可激活Caspase蛋白酶、JNK（Jun kinase）和转录因子NF-κB三条信号通路，其中NF-κB促进存活，而JNK加速细胞死亡，TNFa介导的JNK活化可加速NF-κB诱导的Caspase-8的抵制剂、抗调亡蛋白c-FLIP的逆转[16]。有研究发现用TNF-α对人唾液腺（human salivary gland,HSG）细胞进行处理后，能促使Fas受体表达增加，激活Caspase-8进而诱导HSG细胞的凋亡[17]。以往研究表明，大鼠颞外段面神经损伤后面运动神经元未见明显凋亡坏死[18,19]。本研究基因芯片检测结果表明患侧面核区细胞因子TNF在伤后表达下调，也再次间接支持凋亡并非外周损伤后面运动神经元主要转归的观点。

信号通路分析结果发现，差异基因整合素β6、Pip5kia、类VAV3致癌基因活跃地参与晚期神经损伤修复活动中的FAK信号通路。细胞粘附分子整合素家族β1与β2于面神经损伤后在面运动神经元内高表达，可将外周轴突芽生的生长锥局限化[20]。整合素β1在细胞表面的成簇表达能够使FAK在黏着斑部位快速集中并同时发生自身酪氨酸磷酸化，或通过与细胞外基质中的特殊氨基酸序列结合，从而激活下游的细胞迁移信号分子如细胞骨架蛋白等，引发细胞的变形、收缩、粘附和迁移[21,22]。推测整合素β6可与细胞外基质结合从而激活FAK信号途径，调节肌动蛋白细胞骨架结构，进而影响细胞黏附、生长及迁移，通过影响晚期塑形活动而影响神经元功能。

表1 差异基因的GO功能注释结果

NM-012786细胞色素C氧化酶8B亚型2.90离子运输NM-030838溶质载体有机阴离子转运家族1a5水通道1脂联素18.63 AA891661 BM386227核蛋白体BF419582 AI454360细胞因子NM-031530 8.47 2.16睾丸表达基因15乙二醛酶域5 2.39 2.57下调-2.35 NM-053960 -2.00 AA819227趋化因子(C-C基元)配体2趋化因子(C-C基元)受体5肿瘤坏死因子（TNF超家族2）-2.17代谢相关L21698 -3.07 AB052846信号传递AF041107 UDP半乳糖转移酶8A甾醇C5-脱氢酶-3.83 -2.44 NM-017028 -2.30 X52711 -6.36 NM-033359细胞粘附NM-053457凝血相关NM-012532转录相关NM-053412 GTP酶激活Ran GAP域样1粘病毒（流感病毒）抗性蛋白2粘病毒（流感病毒）抗性蛋白1神经球蛋白-2.15 claudin 11 -3.00铜蓝蛋白-2.11白介素结合增强因子-2.09内分泌AW524433类RIKEN cDNA 1110038F21 -2.14

神经损伤修复涉及多种靶分子和多条神经信号通路，此基因表达谱芯片虽有高能量的优势，但仍只能着眼于浩大基因库内的一小部分而制约了研究结果的科学价值，例如许多差异表达基因、信号通路在神经损伤再生病理机制中的作用尚未明确，也还不清楚这些基因之间的调控关系和主次关系。若能采用更具体的功能分类基因芯片或定制芯片检测并进行下游验证，将更有助于从基因水平揭示其病理生理过程。

总之，面神经损伤修复过程涉及多因素、多途径的参与，应用基因芯片技术检测伤后晚期面神经核基因表达谱的变化，可为研究阐明面神经损伤后面神经核内塑形变化与面瘫后遗症的产生机制提供新思路。

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（本文编辑：王晶）

Late Gene Expression Profiles of Facial Nucleus in Rat Following Facial-facial Anastomosis

CHEN Pei1,SONG Jun2,LI Chun-li1,ZHANG E1,LUO Ling-hui3,XIAO Hong-jun3,GONG Shu-sheng4.1.Department of Otorhinolaryngology,Wuhan No.1 Hospital,Integrative Medicine Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;2.Department of Otorhinolaryngology, Wuxi Third People’s Hospital,Wuxi 214041,China;3.Department of Otorhinolaryngology,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China;4.Department of Otorhinolaryngology,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Science,Beijing 100050, China.

Objective:To determine the differentially expressed genes of facial nucleus at the late stage of peripheral injury.Methods:The model was set up by facial-facial anastomosis in left facial nerve of rats.Contralateral side was selected as control.At the 90 day post-surgery,the rats were killed.The total RNA of facial nuclei at both sides were extracted;cDNA were obtained from purified total RNA by reversed-transcription.Biotinlabeled cRNA was synthesized by transcription and then was fragmented and hybridized with gene expression profile chip.The gene chip was scanned with scanner.Differentially expressed genes were statistically analyzed for biological function by gene ontology(GO)classes and KEGG pathway.Results:The detection of gene chip showed that 1660 genes were in the facial nucleus of the injury side and 1683 genes were in the healthy side. Three hundreds genes in facial nucleus at injury side,including 157 upregulated genes(difference times≥2)and 143 downregulated genes(difference times≤-2),were shown in differentially expressed profiles as compared to the controls.The differentially expressed genes were classified into functional categories such as cytokines,immune response molecules,signal transduction molecules,ion deliver and cell adhesion molecules,etc by GO analysis.KEGG Pathway analysis screened 32 relevant signal pathways,including leukocyte transmembrane transport pathway and focal adhesion kinase(FAK)pathway(P＜0.05).Conclusion:Multiple genes and complicated signal pathways are involved in the plastic activity of facial nucleus at late stage of peripheral injury and regeneration.

R741;R745.1+2

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.002

1.武汉市第一医院（华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院）耳鼻咽喉头颈外科武汉 430022

2.无锡市第三人民医院耳鼻咽喉头颈外科江苏 无锡 214008 3.华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉头颈外科武汉 430022

4.首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科北京 100050

国家自然科学基金（No.30600699, 30471879）

2015-11-07

陈沛chenpeioto@163. com