人非小细胞肺癌A549细胞异质性研究

石兴源 艾亮梅 黄文瑾 聂 豪 余宏伟 蔡隆梅 周同冲 傅文凡

(广州医科大学附属肿瘤医院放疗四科，广东 广州 510095)

·论著·

人非小细胞肺癌A549细胞异质性研究

石兴源*艾亮梅 黄文瑾 聂 豪 余宏伟 蔡隆梅 周同冲 傅文凡

(广州医科大学附属肿瘤医院放疗四科，广东 广州 510095)

目的:分析肺癌A549细胞的异质性特征。方法：有限稀释法分离A549细胞的单个克隆细胞并扩大培养，对亲代与子代细胞进行生长、转移等特征的分析，了解A549细胞内部存在的异质性特征。结果：共获得6个A549细胞子细胞株，与亲代细胞比较，各子代细胞在细胞增殖能力和转移特征方面存在明显差异(P<0.05)。结论：A549细胞存在细胞增殖能力和转移特征的异质性，可能与肿瘤的发生转移相关。

非小细胞肺癌；肿瘤异质性

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的85%左右，是一种威胁人类健康的恶性肿瘤之一。手术、放疗、化疗和靶向治疗是目前NSCLC治疗的主要手段，其中后两种治疗方式是NSCLC全身治疗的两种主要方式[1]。对于化疗来说，含铂两药方案为临床主要使用的化疗方案。而对于靶向治疗来说，针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)标靶的小分子酪氨酸激酶活性抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)靶向治疗是目前临床应用最多的。然而，对于这两种主要的NSCLC全身治疗方法，耐药是一个难以回避的问题[2-3]。目前的研究显示，NSCLC的化疗与靶向治疗耐药机制主要包括：多种蛋白、酶和基因综合作用的结果,靶分子出现继发改变,信号转导旁路激活,微环境变化等。除此之外，也有研究显示肿瘤细胞的克隆异质性也与NSCLC的化疗与靶向治疗耐药相关。

肿瘤的异质性是指肿瘤在发生与发展过程中，其不同肿瘤子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤呈现不同的生长、侵袭、药物敏感性、预后等特性。肿瘤的异质性包括空间异质性和时间异质性。所谓空间异质性主要指在相同时间点的同一肿瘤内或不同肿瘤病灶间的肿瘤子细胞的差异性，而时间异质性则是指当肿瘤在接受药物治疗等情况下出现肿瘤微环境变化而导致的在不同时间点的肿瘤子细胞的差异性。而这不同的肿瘤异质性特征导致了同种肿瘤可呈现显著差异的临床表型。相关文献报道，在EGFR基因突变检测结果为存在敏感突变的NSCLC患者中，接受TKI治疗时的药物反应性却存在较大的差异。同时，当TKI治疗了一段时间患者开始出现耐药表现时，其具体的表现形式也存在明显差异，可分为爆发进展、缓慢进展和局部进展三种模式[4]，而针对这不同的耐药模式，临床也采取了相应的不同治疗方案来给予患者个体化治疗。因此，发现更多的NSCLC患者可能存在的肿瘤异质性特征对于肿瘤的疗效与预后预测和指导个体化治疗具有重要意义。

本研究拟以人非小细胞肺癌细胞系A549为研究对象，结合有限稀释法建立多个单克隆化的子细胞株，并对其进行表型和基因型分析，为后续研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

美国Life公司：1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶；美国Promega公司：MTS；美国SHELLAB公司：CO2培养箱；德国徕卡公司：DMI4000B倒置显微镜；美国BioTek公司：Synergy2多功能酶标仪。

1.2 细胞培养

A549在中科院上海细胞所购买。细胞置于1640培养基(含10%胎牛血清)中在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 有限稀释法

将对数生长期的A549细胞用胰酶处理后获得细胞悬液，利用1640培养基将细胞稀释至每200 μL生含1个细胞的浓度，将稀释后细胞按每孔200 μL的量分装至整块96孔培养板中培养。挑选含单个细胞克隆的孔待细胞长满后转6孔板做扩大培养以建立子细胞株。

1.4 大体观察

显微镜下观察各细胞克隆形态特征。

1.5 克隆形成实验

将待检细胞稀释，其后按400个细胞/孔接种6孔培养板，每个细胞设3复孔，培养8天后弃上清，预冷甲醇固定30分钟，结晶紫染色后清水冲洗、晾干。计数克隆数以及克隆形成率(克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%)。

1.6 细胞增殖曲线

稀释待检细胞，按1000个细胞/200 μL/孔浓度接种96孔板，每个时间点设置5个检测复孔，在接种细胞贴壁后分别在0、24、48、72、96、120 h加MTS37 ℃放置3 h后测吸光度值(A)，利用各时间点测量值均值绘制细胞增殖曲线。

1.7 划痕实验

稀释待检细胞，取3×105细胞接种6孔板，待细胞铺满培养孔底后更换无血清培养基，其后用小吸头垂直划线，0、24、48定位观察细胞迁移情况。

1.8 基因突变检测

依据EGFR基因突变检测试剂盒(直接测序法)说明书步骤检测各子细胞克隆的EGFR基因突变情况，观察是否存在EGFR基因异质性情况。

1.9 统计分析

应用SPSS 16.0统计学软件处理相关数据。计量资料以表示，采用单因素方差分析比较组间差异。

2 结 果

2.1 大体观察结果

通过有限稀释法自A549细胞中得到20个单细胞培养孔，其中仅6个孔的单细胞最终成长形成克隆并扩大培养获得子代细胞(分别标记为1-6号克隆)，占比30%。在单细胞首次形成克隆时，不同克隆具有两种不同的克隆形态，第一种克隆形态为紧密型克隆，克隆内细胞结合紧密，克隆边界清晰。第二种克隆形态为散在型克隆，细胞间结合松散。见图1。在所获得的6个子克隆中：2、3、5、6号克隆为紧密型克隆，占66.7%；1、4号克隆为散在型克隆，占33.3%。

BA

A.紧密型克隆;B.散在型克隆

图1 A549单细胞形成的子克隆形态

2.2 克隆形成实验结果

A549的克隆形成率为(52.6±3.4)%；1-6号子细胞的克隆形成率分别为：(25.3±4.8)%、(70.2±5.4)%、(50.2±4.4)%、(12.2±5.6)%、(44.4±3.4)%、(66.5±3.9),存在明显差异(P<0.05)。

2.3 细胞生长曲线

通过生长曲线可见A549细胞与2、3、6号克隆显示出较强的增殖活性，其中2号克隆最强，而1、4号克隆的增殖活性较弱。见图2。

76543210244872960120t/min增殖倍数NCI-A5491号克隆2号克隆3号克隆4号克隆5号克隆6号克隆

图2 细胞增殖曲线

2.4 划痕实验结果

2号克隆48小时划痕两侧细胞相接，A549与其他克隆48 h划痕两侧细胞仍未相接，故存在差异。

2.5 EGFR基因突变检测结果

利用直接测序法对A549与1-6号克隆细胞的EGFR基因(18-21外显子)突变状态进行检测，所有细胞的18-21外显子均为野生型，未见差异。

3 讨 论

关于肿瘤异质性的来源有两种不同假说，其一为克隆演化假说，其二为肿瘤干细胞假说[5]。克隆演化假说认为虽然大多数肿瘤在发生时多为单克隆起源，但在发展过程中，在肿瘤细胞内存在着的克隆演化过程导致了肿瘤产生了异质性，也即逐步体现为多克隆性，其中占主导的克隆形成肿瘤的干系，而一些次要克隆则构成旁系。干系和旁系的基因型和表型可能存在差异，甚至在染色体层面也存在差别，这就为肿瘤临床表现和治疗反应性的差异打下了基础，并且存在高度的复杂性。而肿瘤干细胞假说则认为在肿瘤中存在一小群干细胞样细胞，这群细胞具有无限增殖和多向分化的潜能，因此在肿瘤的发生发展过程中，为适应肿瘤微环境的改变，由干细胞分化产生了多种不同的差异细胞，而这些差异细胞就是肿瘤异质性的来源。在该研究中，通过有限稀释法获得的单个A549细胞并非均能重新生长形成克隆，其中70%的细胞死亡，只有6个细胞最终生长为克隆，该结果提示在A549细胞中存在部分具有自我更新能力的细胞。另在已分离且扩大培养的单克隆细胞中存在两种形态差异明显的细胞克隆，其中以紧密型克隆为主。多项研究表明[6,7]，在不同的细胞株中分离的单克隆细胞可有三种类型，包括Holoclones、Paraclones和Meroclones，其中Meroclones是Holoclones和Paraclones的混合体，同时不同的克隆其克隆形态特征存在明显差异，Holoclones因其具有生长快且具自我更新能力的特征被认为是具有干细胞特性的一类克隆。在该研究中，紧密型克隆其生长能力普遍强于散在型克隆，故应属于文献中的Holoclones类型，与相关文献报道相符。但紧密型克隆的比例可达到66.7%，较文献报道偏高，分析其原因为显微镜下人为依据大体形态区分克隆类型其准确率较低，但此类划分可为后续研究提供有用的线索。

对于肺癌来说，EGFR基因突变是一种重要的驱动基因改变，其与TKI类靶向药物的疗效取得密切相关。该研究以EGFR基因突变为对象，分析了A549细胞及其各子克隆细胞的EGFR基因突变状态，均未发现存在EGFR基因突变的情况。提示A549细胞是一种TKI耐药的肺癌细胞，在此类耐药细胞中未发现存在EGFR基因突变的提示对TKI敏感的微克隆。

相关研究显示[8]，肿瘤细胞的遗传不稳定性和肿瘤微环境是影响肿瘤异质性的两种主要因素，同时各种不同的肿瘤细胞克隆间又呈现一种竞争与协同的相对稳态。当肿瘤微环境出现变化时(如使用药物治疗)，则具有不同相对稳态的肿瘤细胞群体对于微环境的改变其反应性也存在差异，同时当微环境改变一段时间以后，不同于之前的新的肿瘤克隆稳态又可能重新形成[9]。因此肿瘤细胞的异质性差异还可能与肿瘤的药物治疗反应性及耐药机制相关。在该研究中，虽未直接进行A549细胞及其各子克隆细胞的耐药性分析，但各子克隆细胞间生长能力的明显差异也提示可能存在其对不同药物反应性的差异。

综上所述，A549细胞在细胞克隆形态以及生长特性等表型方面存在异质性。

[1] 白玉梅, 卢保华. 非小细胞肺癌治疗进展[J]. 山西医药杂志月刊, 2013, 42(7):767-768.

[2] 张 钰, 周建国, 马 虎. 非小细胞肺癌分子靶向治疗及其耐药[J]. 国际肿瘤学杂志, 2016, 43(1):45-48.

[3] 付 刚, 潘明佳, 龚 珉, 等. 非小细胞肺癌化疗耐药相关的生物标志物研究进展[J]. 现代药物与临床, 2011, 26(6):421-425.

[4] 龚承岚, 张国伟, 王慧娟, 等. 从EGFR基因突变看肺癌异质性[J]. 河南医学研究, 2014, 23(5):155-159.

[5] 杨壹羚, 褚嘉祐, 王明荣. 肿瘤遗传异质性[J]. 遗传, 2013, 35(1):1-9.

[6] 黄盛东, 刘晓红, 白辰光, 等. A549肺癌细胞株中肿瘤干细胞与克隆形成的关系 [J]. 中华实验外科杂志, 2006, 23(9):1053-1055.

[7] 周 静, 赵 刚, 刘 涛, 等. 实体肿瘤干细胞的研究进展[J]. 中华实验外科杂志, 2006, 23(1):122-123.

[8] 吴克复. 肿瘤微环境与细胞生态学导论[M]. 北京:科学出版社, 2009:212-214.

[9] 付秀华，宿利清.肺癌体外药敏试验与临床疗效的关系[J].中华生物医学工程杂志,2011,17(4):318-320.

(本文编辑：郑 颖)

Heterogeneity of human non-small cell lung cancer cell line A549

ShiXingyuan*,AiLiangmei,HuangWenjin,NieHao,YuHongwei,CaiLongmei,ZhouTongchong，FuWenfan

(FourthDepartmentofRadiationOncology,TumorHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China)

*Correspondingauthor:Email：18549183@qq.com

Objective:To analyze the heterogeneity of lung cancer cell line A549. Methods: Limiting dilution was used to isolate the single clones of A549 cells and expanded for culture. Then, the growth and metastasis of the parental and offspring cells were analyzed to determine the heterogeneity of A549 cells. Results:Six sub-cell lines were isolated. There were significant differences in the proliferation and metastasis between the parental and offspring cells. Conclusion:A549 cells show heterogeneity of cell proliferation and metastasis, and the heterogeneity may be related to tumor metastasis.

non-small cell lung cancer; tumor heterogeneity

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.06.001

广州市医药科技项目(20142A011023)

R734.2

A

2095-9664(2016)06-0001-03

2016-10-27)

*通讯作者：Email：18549183@qq.com