参附注射液对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用

黄约诺 黄立搜 徐鹏 陈素珍 楼黎明

[摘要] 目的 探讨参附注射液对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用。 方法 采用盲肠结扎穿孔术（CLP） 建立大鼠脓毒症模型。健康成年雄性SD大鼠72只，随机分为三组，每组24只：假手术组、脓毒症组、参附干预组。动物模型制备成功后，各组在腹腔注入参附注射液（10 mL/kg）或等量生理盐水后，于术后3 h、12 h和24 h检测肺组织匀浆标本超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、黄嘌呤氧化酶（XO）活力和丙二醛（MDA）含量。结果 与脓毒症组比较，参附干预组大鼠肺组织SOD、GSH-Px活性显著升高（P<0.01），而XO、MDA水平显著降低（P<0.01）。 结论 参附注射液可通过减少肺氧自由基的产生，减轻肺损伤。

[关键词] 参附注射液；脓毒症；肺损伤；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；黄嘌呤氧化酶；丙二醛

[中图分类号] R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）06-0026-03

Protective effects of Shenfu injection on lung injury in rats with sepsis

HUANG Yuenuo HUANG Lisou XU Peng CHEN Suzhen LOU Liming

Department of Respiratory Diseases， the Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of Shenfu injection on pulmonary injury induced by sepsis in rats. Methods Cecal ligation and puncture（CLP） model was used to generate sepsis in rats. SD 72 male rats were randomly divided into three groups with 24 cases in each group： sham operation group， sepsis group， Shenfu intervention group. After generating the animal model groups successfully， injecting Shenfu injection（10 mL/kg） or normal saline in the abdominal cavity， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， xanthine oxidase （XO） activity， malondialdehyde（MDA） contents in lung tissue homogenate were observed 3 hours， 12 hours and 24 hours after CLP. Results Compared with the sepsis group， rats lung tissue SOD， GSH-PX activity of Shenfu intervention group significantly increased（P<0.01）， and XO and MDA levels significantly reduced（P<0.01）. Conclusion Shenfu injection can reduce the pulmonary injury by decreasing the production of oxygen free radicals.

[Key words] Shenfu injection； Sepsis； Pulmonary injury； Superoxide dismutase（SOD）； Glutathione peroxidase（GSH-Px）； Xanthine oxidase（XO）； Malondialdehyde（MDA）

脓毒症是临床上常见的急危重症之一，除可引起剧烈的全身炎症反应外，还可导致多脏器功能不全。在众多脓毒症并发的器官损伤中，脓毒症导致的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）发生早、病情重，是加速患者死亡的重要原因之一[1]。盲肠结扎穿孔术（CLP）模型是目前公认的脓毒症模型[2]，广泛应用于基础研究。参附注射液在临床上广泛应用于危重患者的救治，本研究采用CLP制备大鼠脓毒症模型，观察参附注射液对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

健康成年雄性SD大鼠72只，体重量280～350 g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 药物与试剂

参附注射液（规格：50 mL/瓶，批号：15130064175，雅安三九药业有限公司）；黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）试剂盒：生产公司：美国RND公司，批号：R3201L。丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：生产公司：美国RND公司，批号：R4785L。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）试剂盒：生产公司：美国RND公司，批号：R4421L。谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒：生产公司：美国RND公司，批号：R7098L。

1.3 分组及模型制备

健康成年雄性SD大鼠72只，随机分为三组，每组24只：假手术组、脓毒症组、参附干预组。采用胡丹丹等[3]建立的CLP法制备大鼠脓毒症模型，动物模型制备成功后，各组在腹腔注入参附注射液（10 mL/kg）或等量生理盐水。

1.4 标本采集

术后3 h、12 h和24 h各组分别取8只大鼠，给予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射进行麻醉，经腹主动脉采血处死。处死大鼠后，留取左肺固定于4%甲醛中准备石蜡包埋切片行HE染色，留取右肺置于-70℃冰箱，用于制作肺组织匀浆。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肺组织匀浆标本黄嘌呤氧化酶（XO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量。

1.5 肺组织病理改变

将取出的肺组织、用梯度酒精脱水、浸蜡和包埋，制成石蜡块，用苏木素染色，盐酸酒精分化及自来水返蓝，之后伊红染色，再次脱水、透明、封片，于显微镜下观察炎症细胞浸润，光学显微镜下进行肺组织病理观察。

1.6 统计学方法

所有数据应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理结果

假手术组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，水肿和炎症渗出少；随着时间的推移，与假手术组比较，模型组肺组织可见炎性细胞浸润逐渐加重，肺水肿、出血以及肺不张逐渐加重，肺泡间隔逐渐增厚并破坏；参附干预组肺组织可见炎性细胞浸润逐渐减轻，肺水肿、出血以及肺不张逐渐减轻，肺泡间隔逐渐修复。见封三图4。

2.2 各组大鼠肺组织中XO、MDA、SOD、GSH-Px的含量比较

与假手术组比较，脓毒症组大鼠肺组织XO、MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px含量显著降低（P<0.01）；与脓毒症组比较，参附干预组大鼠肺组织XO、MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px含量显著升高，差异均有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。

3 讨论

脓毒症是临床常见的危重症，是由细菌感染引起的全身炎症反应（SRIS）最常见的并发症，具有高发病率、高死亡率等特点[4]，导致肺、肾、肝、肠道等多脏器功能障碍，而肺往往是最早、最易受损的靶器官，因此，脓毒症肺损伤往往是最常见的死亡原因[5]，表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。目前其机制尚未完全明了，且缺乏针对性的干预措施，所以研究脓毒症导致肺损伤机制及其治疗具有重要的意义[6]。

氧化应激在脓毒症的发生、发展中起了重要的作用，氧化应激产生的自由基破坏细胞的结构和功能。氧化应激不但氧化蛋白质，改变蛋白质活性，导致蛋白酶释放，使抗氧化剂和抗蛋白酶失活，而且可以直接损伤DNA导致断裂和点突变；导致脂质过氧化，产生血管活性物质和前炎性物质，导致肺微血管完整性和肺泡屏障破坏，引起肺表面活性物质减少，从而导致急性肺损伤的发生[7]。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是嘌呤核苷酸的分解代谢酶， 反映缺氧损伤的情况[8]。急性肺损伤时，机体内XO活性增高， 则氧自由基生成增多。丙二醛（malondialdehyde，MDA）反映体内氧自由基生成量及活性，间接反映细胞受损的程度[9]。MDA含量增加表明CLP术后氧自由基产生增多，细胞膜脂质过氧化增多，肺泡细胞受损[10]。超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，具有保护肺损伤的作用[11]。胞外SOD 的活性水平与肺损伤的程度呈负相关[12，13]，而氧化应激产物可降低SOD活性[14]。谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是氧自由基清除酶，是肺组织重要的抗氧化防御因子，保护机体免受脂质过氧化物的损害[15]，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。

中医学虽然没有脓毒症、急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等病名，但根据其临床表现：咳嗽咳痰、气急、进行性呼吸困难、气促喘憋、紫绀等肺气壅遏的症状，将其归属于中医学的温病的范围，病机为外感温热毒邪，邪侵犯于肺，热入阳明，邪与肠中积滞相结，导致热结肠燥，气滞壅结，上逆则喘，中阻则满，邪热迫瘀，瘀与热互结，毒邪瘀积，壅滞在肺，致肺失司，失通调水道功能，而水液内停，从而出现肺气壅遏等症状[16，17]。且认为其根本病因为正气不足，邪气盛实。《素问遗篇·刺法论》说：“正气存内，邪不可干”，《素问·评热病论》说：“邪之所凑，其气必虚”，从根本上阐述了疾病的发生及发展的内在因素——“正虚”，同时也为防治脓毒症及脓毒症器官损伤提供了理论依据——“扶正祛邪”[18]。

参附注射液是由中医方剂“参附汤”科学有效分离提取而制成的中成药注射剂，其组方来源于《济生续方》之参附汤，由人参和炮附子组成。具有回阳救逆，益气固脱等作用，临床上主要应用于阳气暴脱之厥脱证，或阳气虚所致的惊悸、怔忡、喘、咳、胃痛病、泄泻病、痹证等疾病。方中人参：性味甘温，具有振奋元气，益气固脱，回阳救急的功效，又善于补气生血，补益肺脾，故有“扶正补虚之第一要药”之称，《神农本草经》 谓其“主补五脏， 安精神……除邪气”，现代药理研究发现，人参含有多种人参皂苷，具有抗疲劳、抗休克、促进蛋白质的合成及增强机体免疫力的功效。炮附子：性味辛热，纯阳燥烈，补火助阳，可通行十二经脉，温一身之阳气，上助心阳以通脉，下补肾阳以益火，有“回阳救逆第一药”之称，《本草纲目》谓其“治三阴伤寒……中寒中风，痰厥气厥”，现代药理研究发现，炮附子含有乌头类生物碱，具有抗休克、扩充血管、增加血流、改善循环的作用，其对急性炎症模型有明显抑制作用[19]。二药相配伍而使用，人参不仅可以制约附子的毒性，又可增强附子的功效，二者相合发挥增效减毒之妙[20]。正如晚清名医郑肖岩称参附汤为“扶危之至宝，救急之灵丹”[21]。

既往研究发现其具有抗缺血、抗缺氧、清除氧自由基、抗脂质过氧化等作用，反映了参附注射液对脓毒症时组织氧自由基损伤的保护作用。我们的研究显示，CLP能使大鼠体内抗氧化功能下降，自由基产生过氧化反应增加，脓毒症大鼠体内存在氧化损伤，大量SOD、GSH-Px被自由基灭活；参附注射液各剂量组大鼠肺组织SOD、GSH-Px的生物活性明显增强。已有研究显示氧化应激在急性肺损伤发病中起关键作用，抗氧化剂对急性肺损伤有保护作用[22]。通过药物从细胞及分子水平抗氧化应激对治疗急性肺损伤是有现实意义的。对于急性肺损伤，参附注射液具有一定的保护脓毒症肺损伤的作用。其机制可能是通过加强肺组织的抗氧化酶的活性，减少氧自由基的产生，减轻脂质过氧化有关。虽然近年国内外众多学者对脓毒症的发病机制及治疗进行大量的研究。但由于脓毒症发病机制过于复杂，其具体机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2015-12-25）