α—淀粉酶对类黄酮抗氧化活性的影响

陈磊　苏焕斌　韩振亚　罗永潮　邱国栋

类黄酮的化学结构及其取代基的位置基本决定了它们的抗氧化效果。目前广泛认为，B环是类黄酮抗氧化能力、清除自由基的重要活性部位，一般情况下，B环上羟基基团越多，其生物活性就越强。而羟基基团的糖苷化和2、3位双键氢化都容易引起类黄酮生物活性的降低。

该文通过采用氧自由基清除能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）评价法、DDPH自由基清除法、抗亚油酸氧化法、还原能力法四种不同的抗氧化活性评价方法，旨在测定类黄酮在加入PPA溶液前后，类黄酮抗氧化能力的变化情况。

材料与仪器

PPA购自于Sigma公司；类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度达98%；荧光素钠，维生素E水溶性类似物Trolox，2，2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2-Azobis（2-methylp ropionamidine）dihyd rochIo ride，AAPH），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DDPH），亚油酸均購自于Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯，所有溶液均用等离子水配制，并用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）以保持pH6.8±0.02的生理条件。

全波长扫描式多功能酶标仪，紫外可见分光光度计数显，恒温水浴锅，pH值精度计，超声细胞粉碎器，数控超声波清洗器

试验方法

PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的影响。称取1mg类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于2mL二甲基亚砜，得到0.5mg/mL的类黄酮储备液。取10μL类黄酮储备液与9901JLPPA液（溶于pH7.4的PBS缓冲液，0.328U/mL）、990mLpH7.4的PBS缓冲液，混匀于37℃反应30min，分别得到1mL两组样液并加以标记为样液1和样液2。同时，将类黄酮储备液换成等体积的二甲基亚砜作同样处理，作为对照以排除二甲基亚砜对整个试验结果的影响。

在96微孔平板中依次加入20μL上述两种样液、对照液和五种不同浓度的Trolox标准溶液，板的边缘孔均加入等体积的pH7.4的PBS缓冲液；然后每孔加入200pL的已配置好的荧光素钠盐溶液（现配现用），再运用Wallace1420Manager软件设定测定程序，自动混匀，在37℃条件下预热20min；待96孔平板出机后，迅速加入20μLAAPH（现配现用），自动混匀，仪器开始自动测定。在激发波长485nm，吸收波长535nm条件下，每隔2min记录一次荧光强度值，每次纪录前自动震荡混匀8s，共测定60个循环，荧光强度分别记录为f1，f2，f3，……，f60；利用相应软件计算AUC值，再计算ORAC值。则PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的抑制率算术公式如下：

PPA对类黄酮清除DDPH自由基的影响。准确称取20mgDDPH粉末，用无水乙醇溶解并定容至250mL，得到摩尔浓度为2×10^-4mol儿的DDPH乙醇混合液，现配现用。

将类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于无水乙醇，得到20，40，60，80，100μg/mL不同浓度的类黄酮溶液。取50HL上述不同浓度的类黄酮溶液与0.2mLPPA液（溶于pH6.8的PBS缓冲液，0.328U/mL）混合并于37℃水浴30min，再加入3mL的2×10^-4mol/L的DDPH乙醇混合液，混匀后，在黑暗处室温条件下静置30min。用无水乙醇作为参比液，在517nm处测定样品的吸光值。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的无水乙醇，平行测定三次。则通过拟合曲线可得类黄酮加入PPA溶解液前后的半抑制浓度UC50值，以及PPA对黄酮抗亚油酸氧化的抑制率的算术公式如下：

PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的影响。称取亚油酸0.6g，吐温-20 0.5g溶于150mL pH 6.8 0.2mol儿的PBS缓冲液中，在超声细胞粉碎器下工作20min，得到均一体系的混合液。

将0.2mL0.1mg/mL的黄酮液（溶于二甲基亚砜），不同酶活力的PPA液先混合37℃水浴30min，再加入上述混合液2.5mL，5mL20mMAAPH反应液混合均匀于反应器中恒温水浴70min。

取出上述反应液0.1mL于具塞试管中，加入4.7mL乙醇（75%），0.1mL硫氰酸铵（30%）和0.1mLFeCl₂（20mM，溶于3.5%HCl中）混匀，在500nm处测得吸光度值A500（以75%乙醇作参比液）。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的二甲基亚砜液，平行测定三次。则PPA对黄酮抗亚油酸氧化的抑制率的算术公式如下：

PPA对类黄酮还原能力的影响。将0.05mg/mL100μL黄酮液（溶于二甲基亚砜）与不同酶活力的PPA液混合于37℃恒温水浴锅内水浴30min，依次加入2.5mL0.2mol/L的PBS缓冲液和2.5mL已配置好质量分数为1%的K₃Fe（CN）₆，再置于50℃水浴锅内保温20min后，快速冷却，加入2.5mL质量分数10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的转速离心10min，取离心后的上清液2.5mL，依次加入4mL蒸馏水，1mL质量分数0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度A700（以蒸馏水为参比液）。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的二甲基亚砜液，平行测定三次。则PPA对黄酮还原力的抑制率I的算术公式如下：

结果与分析

PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的影响。ORAC评价方法是依据氧自由基（AAPH）破坏荧光探针，促使荧光强度发生一定程度的变化，同时以维生素E水溶性类似物Trolox作为定量标准，采用多功能荧光微孔板扫描分析仪加以检测分析。荧光强度的比那话大小反映了自由基破坏的程度。当抗氧化剂存在时，抗氧化剂可以抑制自由基破坏荧光探针，延缓其荧光强度的衰减速度，通过分析计算得出的ORAC值反映了抗氧化剂对自由基的抗氧化能力。

从图1中可以看出，PPA对类黄酮ORAC抗氧化体系的抑制作用不太明显，其中对木犀草素的抑制作用最大，其抑制率也只有19.88%，对槲皮素的抑制作用最小，其抑制率仅为3.56%。PPA对六种类黄酮ORAC抗氧化体系的抑制作用大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。这种结果可能表明PPA与类黄酮相互作用的结合位点不在类黄酮清除自由基能力的活性部位（酚羟基），也間接说明了氢键对PPA和类黄酮发生相互结合作用的贡献不大，但与两者间的结合强度存在一定的联系。

PPA对类黄酮清除DDPH自由基的影响。DDPH自由基溶于乙醇溶液后，在可见光范围内517nm处有强吸收，呈深紫色，当加入自由基清除剂（抗氧化剂）后，其与DDPH自由基中的单电子配对从而使DDPH自由基在517nm处的强吸收逐渐消失，吸光值与DDPH自由基接受的电子数量呈一定的定量关系。

如表1所示，PPA对六种类黄酮清除DDPH自由基的能力均具有一定程度的抑制作用，但抑制作用程度不大。其中PPA对木犀草素清除DDPH自由基能力的抑制作用最大，也仅为18.91%。同时，测定类黄酮与PPA反应前后清除DDPH自由基活性的半数抑制浓度（IC50），结果显示类黄酮与PPA反应后的IC50值明显增加。PPA对类黄酮清除DDPH自由基活力的抑制作用强弱顺序为：木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。此外，通过测定类黄酮清除DDPH自由基在加入PPA前后的半抑制浓度IC50值，其结果反映了这六种类黄酮清除DDPH自由基的能力强弱，同时也表现了PPA较小程度地削弱了类黄酮清除DDPH自由基的能力。

PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的影响。图2所示PPA对类黄酮抗亚油酸氧化能力的影响，随着PPA浓度的增大，其对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用就随之增强。PPA（0.082U）对木犀草素抗亚油酸氧化的抑制作用最强，达到44.21%；PPA对槲皮素抗亚油酸氧化活性的抑制作用最弱，仅为17.56%。PPA对六种类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用强度大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。这种结果表明，PPA与类黄酮发生相互结合作用后，在亚油酸乳化体系中，PPA的长分子链可能更紧密地包裹和缠绕类黄酮的活性基团，促使PPA与类黄酮的结合位点及强度发生变化，从而导致PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用增强，具体作用机理有待进一步研究。这也说明PPA与类黄酮相互作用的强弱程度，不仅与两者的化学构造有关，亦与两者混合后所形成的复合物所处的微环境息息相关。

PPA对类黄酮还原能力的影响。抗氧化剂（类黄酮）给出自身电子而具有还原作用，还原能力越强，抗氧化活性越强。试验中的抗氧化剂可使铁氰化钾中的三价铁还原成二价铁，而还原生成的二价铁（亚铁氰化钾）通过与三氯化铁发生进一步反应生成普鲁士蓝，其在700nm处有一强吸收，其吸光值越大，还原能力就越强。

由图3可知，随着PPA浓度的增加，其对类黄酮还原能力的抑制作用也随之增强，但增加幅度不大。PPA（0.082U）对木犀草素还原能力的抑制作用最大，为17.04%；PPA对槲皮素还原能力的抑制作用最小，仅为6.75%。PPA对六种类黄酮还原能力的抑制作用强度大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。

结论

采用ORAC抗氧化体系评价法、DDPH自由基清除法、抗亚油酸氧化法、还原能力法这四种不同的抗氧化活性评价方法，评价了六种类黄酮在与PPA反应前后其抗氧化活性的变化情况。PPA对类黄酮ORAC抗氧化体系、清除DDPH自由基以及还原能力的抑制作用均不明显，最大抑制率分别为19.88%、18.91%、17.04%但在脂质体系内，PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用程度较大，最大抑制率为44.21%。对于上述四种抗氧化活性评价方法，PPA对这六种类黄酮抗氧化活性的抑制作用强弱顺序均为：木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。